08 02金若敏 中药药理学及毒理学研究进展090714.ppt

中药药理及毒理学研究进展  金若敏 上海中医药大学 第一部分 中药血清药物体外实验法 二 基本方法及要点 1.实验动物的选择 1.1 应尽量选用对药物的反应与人类近似的物种 通常血清材料来自于人、大鼠、家兔或豚鼠等。 1.2 注意制备血清的动物应与获取离体器官、组织、细胞的动物一致性。 2.3 给药剂量 受试药物口饲给含药血清供体动物的剂量（动物口服）一般可采用相当于人临床等效剂量的2倍，以g饮片/kg体重或g生药/kg体重表示 2.4 采血时间 影响因素 中药的功效类别、剂型、 机体状态 采血时间 预试 单次给药 药效峰值或药后1～2h内采血 重复给药 末次给药后的1～2h采血 采血部位: 大动脉、大静脉 、心脏 门静脉取血 、门动脉取血 3.含药血清的处理 3.1 血清的分离 通常血液取出后可在室温（或40C，视血清所含药物是否稳定而定)静置2 h 左右，4000 rpm 离心10 min，取上层血清。低温保存，一周内使用。 3.2 灭活 56℃，30min灭活，-20℃保存，一个月内使用 3.3 过滤除菌 微孔滤膜除菌，-20℃或-30℃及-70℃冻存 3.4 其他 丙酮沉淀 4.含药血清在体外实验系统中的用量 一般以占反应系统液体总量的20％或以下为宜。 血清冻干粉 5.设对照组 空白对照——正常血清 四. 应用 （一）在药理学中应用1.抗菌实验研究 杨奎等发现含黄芩霍香正气水、正气液的血清分别具有明显的抑菌作用，抑制率70％。研究还发现一些中药，复方可出现多个抑菌高峰，表明中药抗菌有效成分复杂，可以对细菌给予多次打击，有利于抑制其繁殖。而有一些药的血清相对于正常血清，表现为促进细菌繁殖作用。 2. 观察肥大细胞脱颗粒情况：吸取试管底部肥大细胞，滴1、2滴于中性红染色的载玻片上。高倍镜下观察肥大细胞脱颗粒情况，每张片子查看60个细胞,并按等级序值法测定其等级序值。 表 麻黄连翘赤小豆汤对肥大细胞脱颗粒的影响 3.中药对成骨相关基因表达的比较研究 3.1 方法 含药血清的制备 细胞培养与给药 另选新生1日龄SD大鼠，用酶消化分离法分离培养大鼠颅盖骨成骨细胞。取第二代细胞，接种于培养瓶，24h后弃上清，用10％的含药血清干预成骨细胞，3天换1次液，第7天终止培养。 细胞总RNA的抽提及检测 收集经含药血清培养的成骨细胞，进行RT-PCR扩增、电泳。 检测Cbfal(成骨细胞特异性转录因子和成骨细胞分化调节因子）基因表达。 BMP-2（成骨细胞－2）基因表达。 IGF（胰岛素样生长因子）基因表达 3.2 结果 Cbfal基因表达 自然铜续断当归乳香没药地鳖虫 BMP-2基因表达 骨碎补当归自然铜没药 IGF基因表达 乳香当归自然铜续断 4.对气管平滑肌作用的研究 方法： 豚鼠于实验前禁食12 h，灌胃给予20 g/kg的小青龙汤浓缩液或同容量生理盐水。给药或生理盐水后2小时分别由颈动脉取血，常温下血液凝固后3000 转/分离心取上清夜即为含药血清或正常血清。 每鼠取2ml血清加3~4倍量丙酮混匀，3000 转/分离心，取上清夜，于800C水浴上蒸发，除去丙酮，残留液加蒸馏水至原血清体积，即为处理后的含药血清或处理后正常空白血清。 5. 其他 抗肿瘤研究 对单核细胞产生内生致热源的研究 对缺氧心肌细胞游离钙离子的研究 对血管内皮细胞（EC)保护的研究 对免疫功能的调节：胸腺细胞凋亡 . . . （二）在毒理学中应用川楝子含药血清对大鼠原代培养肝细胞的影响 含药血清的制备： SD大鼠，灌胃给予川楝子150 g生药/kg ,2次，间隔6h，末次给药后2h，无菌取血；将血静置2h，3000 rpm离心10min，分离血清；56℃灭活30min，过滤，分装；－20℃冰箱保存备用。 肝细胞分组检测：正常血清组 川楝子5%含药血清组 川楝子10%含药血清组, 每皿加入血清量相同。孵育1、2、8h、24h时，每皿分别取上清液100μL，全自动生化仪检测ALT、AST、LDH。 结果显示： 与正常组比较，川楝子5%、10%含药血清均可导致肝细胞上清液中ALT、AST、LDH水平不同程度的升高（P0.05 或 P0.01），1h 即显效，在24h最为显著，且呈明显的量效关系。 结语： 中药血清药物体外实验法在研究中药及其复方对组织、器官、细胞、基因等方面的应