外源质粒DNA经胃肠道途径对小鼠免疫功能的影响研究.pdfVIP

2004学术年会 外源质粒DNA经胃肠道途径对小鼠免疫功能的影响+ 刘建丈，乐国伟，施用晖，方希修 江南大学营养与生物技术教研室江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214036 摘要：目的：本实验研究了外源质粒DNA经胃肠道吸收后对小鼠免疫功能的影响。方法：观 察外源质粒pcDNA3对小鼠胸腺、脾脏指数，脾脏淋巴细胞转化率，脾脏抗体细胞生成含量，血清 溶血素水平，巨噬细胞吞噬指数及吞噬率的影响，并考察了外源质粒pcDNA3对免疫低下小鼠血清 脏淋巴细胞转化率，脾脏抗体细胞生成含量，血清溶血素水平(PO．05)，巨噬细胞吞噬指数及吞噬率 道途径摄入后能够诱导小鼠广泛的体液免疫和细胞免疫应答。 关键词：外源质粒，免疫，胃肠道 1 前言长期以来人们一直把DNA作为一种遗传物质，将其与免疫活性联系起来只是近20年来 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、双歧杆菌等细菌DNA也得出相似结果。经分析发现，这些DNA片段 中均含有非甲基化的CpG基序(CpG 酸出现1次，为非甲基化修饰，它所具有的免疫调节作用为众多学者所证实。细菌DNA不仅可以 诱发抗体，还能调节小鼠B细胞和T细胞的功能，并刺激巨噬细胞产生细胞因子，增强机体天然免 基化的CpG序列具有免疫刺激作用，能够促进多种免疫细胞活化，诱导细胞因子的产生，使机体产 生快速高水平的抗体应答及细胞免疫应答。 最有可能让外源DNA接触的就是肠胃道，动物通过进食每天都要摄入大量的外源DNA。 DNA M13mpl8DNA，在小肠、盲肠、大肠和粪便中均可检测到M13碎片。组织和粪便中的M13 占总M13 而以缓冲液灌喂的对照组中，则无M13存在。通过PCR法发现血液白细胞2—8小时内存在M13， 荧光免疫原位杂交(FISH)发现24小时内脾脏和肝脏细胞仍存在有M13。此外在脊柱上皮细胞、 盲肠淋巴结的白细胞、肝细胞、脾脏的B细胞、T细胞和巨噬细胞中，FISH法均可追踪到M13DNA。 实验表明外源DNA能够由肠壁上皮细胞吸收，经淋巴结，然后通过外周血液白细胞运送到各个器 官中。 目前外源质粒DNA导入机体的主要方式有肌肉注射、腹腔注射及基因枪轰击等，通过肠道途 径免疫方式因效价低一直不为人们所重视。肠道具有作为人体最大免疫器官的功能，全部末梢淋巴 结的50。60％都集中在肠道中。这些肠道中的淋巴结(淋巴群)、肠系膜淋巴结，它们位于肠道上皮 +基金项目：国家自然基金项目 2004学术年会 间，黏膜固有层等的肠道处，特别是小肠下段的回肠部。作为消化器官有关的淋巴组织控制着免疫 应答。粘膜表面，特别是肠道上段含有大量的抗原递呈细胞、树状细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞。 它们可以通过胞饮或吞噬作用吞食DNA。外源质粒DNA激活肠黏膜免疫应答有两种途径：(1)外 源质粒DNA进入肠道后直接激活肠道抗原递呈细胞(如DC细胞巨噬细胞)特异性递呈抗原到T 和B淋巴细胞上，诱导抗原特异性免疫应答。(2)一部分外源质粒DNA可以穿透肠黏膜被组织中 的免疫细胞所识别并激活免疫应答。本试验通过口服给药，研究外源质粒DNA通过肠黏膜吸收对 机体产生免疫应答的影响。 2材料与方法 2．1材料 2．1．1动物昆明种小鼠，雄性，体重20129，由江苏省实验动物中心提供。 DH5 q由本室保存。 2．2．1质粒与菌种质粒pcDNA3与含有pcDNA3的E．coil 2．3．1质粒的大量提取与制备 乙二醇纯化，Triton nm／280 X-114去除的内毒素，检测质粒样品在260nln下的吸光度A值，确保 二者之比大于1．8，同时进8 g／L的琼脂糖凝胶电泳确保DNA的完整性并无RNA。 2．4．1试剂RPMI．1640培养基、小牛血清、MTT、谷氨酰胺均购自上海华美生物工程公司， 绵羊红细胞(SRBC)购自无锡市汇生试剂有限公司，豚鼠血清自制。其他试剂均为国产分析 纯。 2_2方法