实验 蛋白质标准曲线的制作精选.pptVIP

学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法 一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G－250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残结合，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是G-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。 蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。 （一）试剂 1. 考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G－250 100mg溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2. 标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白(BSA)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。 （二）器材 721型分光光度计、移液管（1mL，5mL）、试管及试管架 试管编号 0 1 2 3 4 5 1mg/mL标准蛋白（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0.15mol/L NaCl （mL） 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝试剂 （mL） 5 5 5 5 5 5 充分摇匀，20min内以0号管为空白对照,在595nm测定 A595nm － 以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为200μg、400 μg、600μg、800 μg、1000 μg），在坐标轴上绘制标准曲线。 1. 利用标准曲线查出回归方程。 2. 用Excel作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X。相关系数一般大于0.9。 3. 未知样品蛋白质浓度的测定： 测定方法同上，取合适体积的未知样品(奶粉，1g奶粉溶于30mL 0.15mol/L NaCl，3000rpm离心5分钟，取上清待用 )，使其测定值在标准曲线的直线范围内（0～1000μg），根据所测定的A595nm，利用标准曲线或回归方程求出相当于标准蛋白质的量（μg），从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。 一般被测样品的A595nm值在0.1—0.5之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以减少取样量，如果仍然很大，可以定量稀释后再进行测定。 （一）蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内基本稳定。如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 （二）测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 1．Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。 3．测定时仅使用一套比色杯（2个），并从低浓度到高浓度依次测定。中间不要用蒸馏水润洗比色杯，仅用待测液润洗2～3次即可。 另外，还要注意，玻璃仪器要洗涤干净并保持干燥，避免温度变化；取量要准确；分光光度计十分灵敏，测定时要认真仔细。 1．为何制作蛋白质标准曲线？ 2．酶活的一般定义？在提取过程，为何要测定蛋白质浓度？