基因工程ppt03.ppt

?噬菌体生活史 当?噬菌体DNA进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状DNA分子，而后在宿主细胞的DNA连接酶和旋促酶作用下，形成封闭的环状DNA分子，充当转录的模板。 ?噬菌体可选择进入裂解生长状态（lytic growth），大量复制并组装成子代?噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。 经过40-45min的生长循环，释放出约100个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）； 或者进入溶原状态（lysogenic state），将?噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体DNA中，并随宿主的繁殖传给子代细胞（图3-7）。 图3-7 ?噬菌体生活史简图 看教材p47 ?噬菌体基因组 ?噬菌体基因组至少可编码30个基因，它们的分布和排列与其功能有一定关系（图3-8，图3-9）。 根据执行功能的不同可将基因组分为三个区。 左边区域:Nu1 到J，其产物用于噬菌体DNA的包装和噬菌体颗粒的形成。 中间区域:J 右边至gam, 编码基因调节、溶原状态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因。其中许多基因对裂解生长是非必须的，在构建载体时可以去掉，用外源DNA片段替代。 右边区域: gam 右边至Rz, 包含噬菌体复制和裂解宿主菌所必须的基因。 图3-8 ?噬菌体基因组的结构示意图 Cro:control of repressor and other thing,抑制子和其他基因的控制 cⅠ:?抑制子基因 cⅡ：转录激活子 xis:切除酶 int:整合酶 N,Q:抗终止子 cⅠ:?抑制子基因。cⅠ蛋白（阻遏物）可阻止裂解生长必需基因的表达。维持溶原状态。 cⅡ： cⅡ蛋白是噬菌体基因转录的激活子。抑制裂解功能基因的表达，催化噬菌体DNA整合到宿主染色体上。激活cⅠ表达。 1.?噬菌体发育调节 （1）吸附（adsorption） ?噬菌体对宿主的侵染是从吸附开始的。?噬菌可吸附在大肠杆菌的外膜受体蛋白上，该蛋白由lam B基因编码，受麦芽糖诱导。 （2）立即早期转录（immediate early transcription） 当噬菌体DNA进入宿主细胞后，线状DNA转变为超螺旋结构的cccDNA。然后利用位于cⅠ基因两侧的PL和PR启动子启动立即早期转录，并终止于N 基因和cro 基因末端的终止子tL和tR1，其中向右侧的转录有40%可终止于tR2，转录出涉及DNA复制的O 基因和P 基因。基因N 的产物具有抗转录终止的作用，且对裂解生长是必需的。 cccDNA :covalently closed circular DNA （3）延迟早期转录（delayed early transcription） 在N蛋白的作用下，转录作用可穿越早期转录终止子tL和tR1，进入延迟早期转录阶段，转录出延迟早期基因cⅢ，以及基因cⅡ、DNA复制基因O 和P、晚期转录的正向调节基因Q 。 基因N 的表达受抑制蛋白CⅠ和Cro负控制，同时也受自身翻译负调节。如果tR2发生缺失突变，则容易进入裂解循环，这样的缺失称为nin突变（nin指不依赖于N 基因）。 在许多?噬菌载体中带有一个nin5突变，该突变缺失了基因P 和Q 之间的tR2和一些与重组有关基因的2 800bp片段。 在延迟早期转录期间，感染细胞朝着溶原化或裂解生长的倾向还不能展现出来。 （4）溶原和裂解的感染分化 在延迟早期结束时，对于进入下一步生长所需的蛋白才会表达出来，从而导致生长方式不可逆地朝着裂解循环或溶原循环方向发展。 对野生型大肠杆菌来说，向溶原和裂解方向的转变是由感染复数（multiplicity of infection）和细胞的营养状态决定的。感染复数越高，营养状态越差，溶原化（lysogenization）的频率就越高。 溶原现象的生化媒介可能是3’,5’-cAMP，它在细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变。 CⅡ:抑制裂解基因表达，催化噬菌体DNA整合到宿主染色体上。 （5）进入裂解生长 基因O 和P 在立即早期转录过程中的转录是微弱的，但在蛋白N介导的抗终止作用下转录活性变的更强。在感染早期，利用蛋白O和P激活的单一复制起点，在宿主的复制蛋白和应激蛋白（stress proteins）的作用下，噬菌体DNA通过θ方式进行复制。 在野生型?噬菌体感染的野生型大肠杆菌中，大约合成50个噬菌体基因组单体后进入滚环复制。 通过复制产生基因组DNA的多联体（concatemer），最后被切割并被包装到噬菌体颗粒中。 图3-10是包装?噬菌体的过程。 （6）溶原化 ?噬菌体感染野生型大肠杆菌后，只有一部分细胞进入裂解循环。相反，在大多数感染的细胞群体中，裂解循环是受挫的，存活的细胞进入溶原状态。 在噬菌体的整合酶Int（integrase）和宿主的整合宿主因子IH