基因工程ppt05.ppt

第5章 表达载体 大肠杆菌表达载体 大肠杆菌表达载体的结构 利用T7噬菌体启动子的表达载体 表达融合蛋白的表达载体 表达产物的纯化 穿梭载体 5.1 大肠杆菌表达载体 5.1.1 大肠杆菌表达载体的结构 大肠杆菌表达载体都是质粒载体。 表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。 基本骨架是最简单的质粒克隆载体中的复制起点和氨苄青霉素抗性基因，相当于pUC类的载体。 在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。 各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。 ⒈ 表达元件 ⑴ 启动子 转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。 当转录启动以后，RNA聚合酶对启动子下游要转录的序列是无法识别的，这就为利用强启动子来表达目的基因提供了可能。 主要3类启动子：乳糖操纵子lac基因的启动子及其与色氨酸合成操纵子中trp启动子拼接形成的杂合启动子tac或trc，所有这些启动子都受IPTG诱导；T7噬菌体启动子；?噬菌体的PL启动子。(注意：表示方法） ⑵ 终止子 转录会受到模板RNA序列结构的影响，当遇到颈环结构时转录便会停止，或遇到ρ因子介导的终止信号转录也会停止。 ⑶ 核糖体结合位点 转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻译出目的蛋白。 细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结合位点以及其中的Shine-Dalgarno序列（SD序列），从而启动邻近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻译。 （表示方法：RBS,rbs，DNA or mRNA上 ) 16S rRNA--------------- ---------------------------16S rRNA UCCUCCA AGGAGGU 5’mRNA----GAUUCCU UUGACCU--AUG-CGA-GCU-UUU-AGU f--Met--Arg--Ala---Phe---Ser – S-D序列与16SrRNA结合示意图 ⒊ 表达的控制 通过诱导来控制的，不同的启动子使用的诱导方式不同。通过诱导，可防止基础表达（渗漏表达），特别是可防止某些有毒产物对细胞的毒害。 (1) 启动子lac及其衍生启动子tac都是诱导型启动子，在IPTG诱导下启动转录。从lac启动子的诱导机制来看，在没有诱导物时，宿主细胞表达的lac阻抑物阻断转录的启动。 过量阻抑物阻断基础表达:在载体上装载一个lacⅠq基因阻抑物编码基因，从而达到严谨调节的目的。 (2) ?噬菌体的PL启动子受cⅠ基因产物的调节，cⅠ阻抑物抑制转录的启动。 利用PL启动子的载体一般在?噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。 溶原性?噬菌体上的cⅠ基因是温度敏感的，如M5219菌株含有cⅠts857突变。在低温（30℃）下，该突变的cⅠ阻抑物能抑制PL启动子的转录，而在高温下（40-45℃）失去活性，PL启动子的活性不受抑制。 5.1.2 利用T7噬菌体启动子的表达载体 pET载体及其表达系统 pET-5a：在载体的基本结构上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。 T7噬菌体启动子：只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录，而大肠杆菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌体启动子。用于表达的宿主细胞必须能表达T7噬菌体的RNA聚合酶。 常用的pET表达载体的宿主菌：大肠杆菌BL21（DE3） 图5-2 大肠杆菌表达载体pET-5a图谱 T7 tag: T7基因10蛋白的氨基末端11aa 控制外源基因严谨表达的2个系统 通过宿主控制T7 RNA聚合酶的量来实现的，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如pLysS或pLysE，它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。 使启动子的控制效应更严谨。在pET载体上装载lacⅠ基因，提高阻抑物的浓度。 也可利用T7-lac启动子（在T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列），当阻抑物结合在lacO位点时，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也无法表达。 只有当诱导物存在时，才能解开T7 RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏。 图5-3是T7启动子