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第二章 PCR原理与技术 Principle and Techniques of PCR 美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B. Mullis 1983年发明，1987年获专利，1993年与Smith一起获Nobel化学奖 recombinant DNA technology, 1970s, First revolutionary technique PCR, 1980s, Second revolutionary technique 一、The PCR in outline （PCR简介） 二、 PCR in more detail （PCR的更多细节） 三、 Research and applying of PCR （PCR技术的研究应用） 本章内容： 一、The PCR in outline （PCR简介） 二、 PCR in more detail （PCR的更多细节） 三、 Research and applying of PCR （PCR技术的研究应用） 本章内容： 一、 PCR 简介 1、PCR反应主要成分: ●模板（ Template ） ●引物（ Primers ） ● Taq DNA聚合酶 ● dNTPs ● Mg2+离子 ●PCR技术：即聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA片段的方法。 ●PCR 扩增的前提条件是： 待扩增DNA片段的两端序列必须是已知的。 2、PCR反应原理示意图 在PCR反应中，首先根据待扩增DNA片段两端的核苷酸序列，化学合成两个不同的寡聚核苷酸引物，它们分别与DNA的两条链互补；然后将过量的引物与四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）、 Taq 酶以及含有待扩增片段的DNA分子（模板）混合，经过高温变性（DNA双链解开）、低温退火（引物与模板结合）和中温延伸（合成新的DNA片段）三个阶段的循环周期，对DNA分子进行扩增。由于新合成的DNA双链能够作为下一循环的模板，所以，一般经过30－35次‘变性—复性—合成’循环后，可使目的基因DNA片段数量达到数百万倍。 ● PCR反应基本原理: 一、The PCR in outline （PCR简介） 二、 PCR in more detail （PCR的更多细节） 三、 Research and applying of PCR （PCR技术的研究应用） 本章内容： 一、The PCR in outline （PCR简介） 二、 PCR in more detail （PCR的更多细节） 三、 Research and applying of PCR （PCR技术的研究应用） 本章内容： 1. 设计PCR的寡核苷酸引物（Primers） 引物的命名: 5’-end primer 3’-end primer Sense primer Antisense primer Forward primer Reverse primer Upstream primer Downstream primer ●根据位置分： ●根据序列性质分： Specific primer (特异） Degenerate primer（兼并） Random primer(随机) 二、 PCR的更多细节（PCR in more detail） 根据已知基因的核苷酸序列设计的引物 根据某基因家族蛋白质的氨基酸保守序列设计的引物 几个寡核苷酸的随机序列，如NNNNNNNNN 2. 引物设计的原则和方法： 1. GC% 45~55% 2. 长度 16~30 3. 碱基尽可能随机分布（避免AAAA等） 4. 注意避免引物内二级结构（如： GCATGATGC） 5. 3’-end 碱基 T is best, A is worst 6. 注意避免两条引物的3’-end 碱基互补 （1）原则： A pair of primers c.上游引物为已知序列的原序列； d. 下游引物为已知序列的反向互补序列； b.引物的书写方式应按 5’-3’方向进行。 a. 引物序列与对应的模板链应该是互补的； (2)方法: How to design a specific primer? 1 cttgaaaaag aatctacctg aaaagaaaaa aaagagagag agatataaat agctttacca 61 agacagatat actatctttt attaatccaa aaagactgag aactctagta actacgtact 121 acttaaacct tatccagttt cttgaaacag agtactctga tcaatgaact cattttcagc