含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病伪狂犬病重组病毒的构建研究.pdfVIP

中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 311 含绿色荧光蛋白基因的猪细小病毒病一伪狂犬病 重组病毒的构建 罗燕，郭万柱。徐志文，刘艳丽，殷华平 (四川农业大学动物生物技术中心，雅安 625014) 摘要；将扩增得到的PPV DNA 和PRvONA共转染vero细胞后通过直接荧光观察、Dot-b10t核酸杂交筛选得到几株重组病毒．将其中一株 电泳和Western免疫印迹检测表明PPVVP2基固在重组病毒内获得表达，产生大小约93kd的融合蛋白，同 时融旮蛋白中的PPvVP2结构蛋白仍然保持了原有的免疫特性，表明成功构建了台绿色荧光蛋白基因的猪细 小病毒病一伪狂犬病重组病毒。 关键词：伪狂夫病毒，猪细小病毒．VP2基园，EGFP．重组病毒 以病毒表达载体为基础的基因工程活载体疫苗是当今病毒病防制研究的热点之一。伪狂犬病毒 (PRV)宿主范围广、不感染人，若缺失主要毒力基因，对动物也不致病，其分子背景比较清楚，可 供外源基因捕入或替代的非必需基因位点多、插入外源基因容量大以及重组病毒的遗传特性稳定，因 此PRV适合于改造成病毒表达载体“1I。除此而外，本研究构建的表达载体是以PRVgI为插入位点， ￡I不仅是PRV的病毒增殖非必需基因区，还参与并决定病毒毒力，外源基因插人gI使其失活，则重 组病毒毒力更有所降低”l，所以本研究选择了PRVm基因作为外源基因的插入区，用于构建转移载体。 构建PRV重组载体时需要在PRV中插人一个报告基因，通过它作为重组病毒的筛选标记。绿色荧光 蛋白(GFP)是20世纪90年代中期发展起来的一种新的报道分子，以其为选择标记不需要任何外源 底物和辅助因子，无毒、稳定、无污染，可在uV或蓝光激发下直接观察。其突变体EGbla荧光强度 有了显著提高，更适合于在哺乳动物细胞中表达睁ll】。PRV和PPV在临床上经常混合感染，因此研制 VP2基因克隆到已构建好的PRV 出这二种病毒的重组疫苗对生产实践具有重要意义。本研究拟将PPV SA215株感染的细胞，通过细胞内同源重组，采用合适的标 表达载体中，然后转染已经被缺失型PRV 记，筛选出带PPVVtx2基因的重组病毒。 1材料和方法 1．1毒(菌)株、细胞和质粒 PPV 建保存。 1_2酶和其他试剂 Kit 收试剂盒购自V-GENE公司。 作者简介：罗燕(1974一)，女，四川康定人，博士，动物病毒分子生物学专业；E_mail：ly=jg@163．com。 通讯作者：wzguo@126．COrn 312 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 1．3 PCR引物的设计及合成 根据AnaI．Ranz等””报道编码PPV I酶切位点；下游引物设置BamHI酶切位点。引物由大连宝生物公 设计一对引物，上游引物设置Kpn 司合成。引物序列为：Pl：5’．rrAGGTACC TG-3’ 1．4 PPV VP2基因的PCR、克隆及其序列测定 RF 在sT细胞上采用早期接种的方法增殖PPV，待细胞出现30—50％左右病变时提取PPVDNA作 Imin、55℃lrrfin、72℃2min．35个循环后，72％延伸10min。经电泳分析PCR产物后，将其克隆到 I和BamHI双酶切鉴定及其测序。 pUCl8中，得到重组质粒pPVP2，Kpn 1．5含PPV VP2基因的PRV基因缺失转移载体质粒(pPI一2．EGFP．VP2)的构建 VP2