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重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建 分子生物学实验-实验操作 基因、载体、受体菌株 基因 载体 菌株 质粒 酶切连接 转化 质粒提取 PCR 实验技术要求 应掌握的实验技术 酶切,连接 凝胶回收 制备感受态细胞 质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳 考察指标 电泳、蓝白斑数量 电泳 感受态细胞转化率 电泳 电泳 电泳 实验流程: 第一天 8AM-5PM (重组载体构建) rhIL-18基因的PCR产物 载体质粒pUC18 BglⅡ和PstⅠ双酶切 BamHⅠ和PstⅠ双酶切 浓度1%琼脂糖凝胶电泳 凝胶回收纯化 电泳检验 T4连接酶连接过夜 配制 LB 液体与固体平板培养基 灭菌 37℃过夜培养 TOP 10菌株 溶液回收纯化 实验流程: 第二天 8AM-5PM (重组载体转化宿主细胞) CaCl2 法制备E.Coli JM109感受态细胞 实验组连接体系 42℃热激转化90s 37℃温柔孵育45min 涂布平板 37℃过夜倒置培养 实验流程: 第三天 1PM-5PM(阳性转化子鉴别及转化效率检验) 观察阴性对照组菌落生长情况 有无菌落 挑取1白色单菌落 37℃液体培养基过夜培养 观察阳性对照组菌落生长情况 统计菌落数量 计算感受态细胞转化效率 观察实验组菌落生长情况 统计蓝斑,白斑菌落数量 观察空菌对照组菌落生长情况 统计菌落数量 观察空菌对照组菌落生长情况 统计菌落数量 第5组Ampc+ 第4组Ampc- 实验流程: 第四天 8AM-5PM(含有目的基因重组载体的鉴定) 提取质粒DNA PCR 浓度1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 浓度1%琼脂糖凝胶电泳 实验流程: 第一天 8AM-5PM (重组载体构建) rhIL-18基因的PCR产物 载体质粒pUC18 BglⅡ和PstⅠ双酶切 BamHⅠ和PstⅠ双酶切 浓度1%琼脂糖凝胶电泳 凝胶回收纯化 电泳检验 T4连接酶连接过夜 配制 LB 液体与固体平板培养基 灭菌 37℃过夜培养 TOP 10菌株 溶液回收纯化 BamH I Pst I Bgl II Pst I 重组载体 Hybrid site Pst I Bgl II Pst I rhIL-18 BamH I Pst I pUC18 BamH I / Pst I Bgl II / Pst I ligation 重组载体构建流程 HYBRID SITE RHIL-18的PCR (1)反应体系 Template DNA 2.0ul 10×buffer 5.0ul MgCl2(25mmol/L) 6.0ul primer1(25umol/L) 1.0ul primer2(25umol/L) 1.0ul dNTP(2mmol/L) 4.0ul Taq酶(5u/uL) 1.0ul 灭菌超纯水 补齐至50ul 引物 IL-B:ATGTCAAGATCTTACTTCGGTAAACTGGAATCTAAACTGTCTG IL-P:TGACATCTGCAGTCACTAGTCTTCGTTCTGAACGGTGAACATG (2)PCR扩增条件: 94℃ 4min 94℃ 30S 55℃ 30S 30个循环 72℃ 60S 72℃ 10min 4℃ — ∞ 双酶切反应(20μL体系) rhIL-18的PCR产物 目的基因 8μL Buffer O 2μL 无菌水 8μL BglⅡ (10u/ul) 1μL PstⅠ(10u/ul) 1μL 质粒pUC18 质粒(PUC-18) 10μL 10×BamHⅠBuffer 2μL 无菌水 6μL BamHⅠ(10u/ul) 1μL PstⅠ (10u/ul) 1μL 37℃酶切反应3小时。 培养基配制 LB液体培养基 每1L配量: 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 5g 滴加5N NaOH(约0.2mL),调节pH值至7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备: 3个30ml 液体培养基 120ml 固体培养基 灭菌 5个培养皿 3个30ml LB 液体培养基 1个120ml LB 固体培养基 一个50m
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