快速、高效家蚕杆状病毒基因表达系统的构建及应用研讨.pdfVIP

生物技术 快速、高效家蚕杆状病毒基因表达系统的构建及应用研究率 曹翠平吴小锋鲁兴萌 浙江大学动物科学学院，杭州，310029 摘要为了较好地解决家蚕杆状病毒基因表达系统在重组病毒构建和纯化过程中存在着重 Bac．to-Bat快速基因表 组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长的缺点，借鉴国外AcNPV 达系统工作原理，利用细菌转座子的基因定位转移作用，对家蚕BmNPV基因组进行改造。 通过同源重组的方法，获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacmid；并利用供体质粒上的 表达盒和细菌转座子，在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合， 快速完成重组BmNPV病毒的构建。 关键词 畜牧学；家蚕；杆状病毒表达系统；细菌转座子 昆虫杆状病毒基因表达系统目前已被证明为表达重组蛋白最有力的工具【l~3】。苜蓿银纹夜蛾核型多角 nuclear morinuclear 体病毒(Autographacalifornica virus，AcNPV)和家蚕核型多角体病毒(Bombyx polyhedrosis polyhedrosis 细胞进行表达生产；后者在具有家蚕资源的中国、日本等国家应用较多。由于BmNPV表达系统可以利用 我国饲养量最大的经济昆虫．家蚕作为表达载体，从而具有成本低、适合产业规模化生产的优点，非常具有 我国特色。我们应用家蚕杆状病毒表达系统己在家蚕体内成功表达生产了人酸性和碱性成纤维细胞生长因 子(aFGEbFGF)H】、人血管内皮生长因子【5】等，并对该表达系统在扩大宿主域、提高表达水平等方面进行了 改进【6，71，使之成为表达和生产重组蛋白一个非常有效的工具。 传统的家蚕重组病毒构建方法分两步进行：首先将目的基因插入到杆状病毒转移质粒中，该质粒含有 杆状病毒启动子(通常为多角体蛋白启动予)和启动子两侧翼同源序列。然后将这样构建的重组转移质粒与 环状的野生型家蚕病毒基因组(约130kb)共转染入家蚕培养细胞。在细胞内通过同源重组发生基因替换(多 角体蛋白基因为病毒复制非必需，可被目的基因替换而不影响病毒的复制)，通常产生约O．1％～1％比例的 含目的基因的重组病毒。随后采用空斑分析的方法，在显微镜下观察细胞的感染症状，通过挑取不含多角 体的空斑进行几轮反复的筛选，最终分离出完全不含多角体的纯重组病毒。在上述过程中由于99％以上为 野生型病毒，而重组病毒不到1％，两者混合在一起，分离比较困难，尤其对于没有经验的人来说这样的 筛选非常难，从而在一定程度上限制了它的应用。通过对病毒基因组的线性化，重组病毒产生的比例可以 提高到近30％t8．91。使用删除了多角体下游部分必需基因的病毒基因组，重组病毒产生的比例甚至可提高 到80％tlo】。但不管那种方法，在共转染后为了除去各种可能的非重组病毒，还必须采用空斑纯化的方法来 得到真正的纯重组病毒。这样至少花费46个星期甚至更长【lkl3】。因此，目前家蚕杆状病毒表达系统仍 存在着重组病毒构建与筛选技术繁琐、花费时间长这一突出的瓶颈问题。 为了较好地解决这个问题，近年来国外成功开发了一种快速、高效产生重组AcNPV病毒的新技 术【14~151。原理是利用细菌转座子的基因转座作用，在大肠杆菌内就能完成重组病毒的构建，取名为 昆虫杆状病毒的构建方法。利用位点特异性转座作用将外源基因插入到能在E．Co／／增殖的穿梭载体Bacmid (病毒基因组改造而来)，快速获得重组病毒DNA的产生。此方法的优点在于：①由于重组病毒DNA在 fl(2003-7．50)、浙江省科技厅项目(2006c24015)资助． ‘本实验受国家重点基础研究发展计划973项目(2005CBl21003)、农业部948 71 中日科协第四届优秀博士生学术年会论文集 细菌内产生，可根据菌斑颜色筛选，不存在野生型和非重组型