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应用文献：Eppendorf 实时PCR 系统 实现快速、准确的定量PCR 实时定量 PCR 技术已经成为分子生物学领域最常用的研究手段之一，该技术通过对目标核酸的精确定量与定性检测，被广泛 用于诸如基因表达分析、基因分型等多种应用中。除了将荧光色素偶联的杂交探针和嵌入式染料用于 DNA 扩增的监测，新近 实时定量PCR 仪器与试剂的研发方向主要着眼于如何缩短运行时间和提高结果的重复性。 Mastercycler ep realplex 是Eppendorf 最新推出的灵活、可靠、特别快速的实时定量PCR 仪，仪器采用模块化的设计，由一 个光学检测单元和一个变温模块组成。紧凑的光学检测单元设计新颖，包括一个发光二极管阵列和先进的光电倍增技术。 realplex2 双通道检测模块可以检测到 520 和 550 nm 波长的荧光，增加一个光电倍增管后，realplex4 四通道检测模块还可以 检测到580 和605 nm 波长的荧光，完成96 孔样品信号记录最快仅需8 秒，最多也只需 16 秒。光学检测单元可以与两种不 同材质的 96 孔温控模块任意组合，除了铝制温控模块外，银制温控模块具有特别显著的升降温速率。两种温控模块均具有梯 度功能，非常方便用户对反应条件进行优化。依据客户的应用需求，仪器可以方便的由一款标准双通道的定量 PCR 仪升级为 最高速四通道的定量PCR 系统。 除了仪器本身的技术优势，试剂产品对实时定量 PCR 分析结果与过程的影响往往是决定性的，Eppendorf RealMaster 定量 PCR 试剂系列，基于 HotMaster 热启动技术，通过引入一个温度依赖的 DNA 聚合酶抑制性配体来保障热启动效果，只有温 度达到60℃酶才被激活，相对于传统的实时PCR 试剂，针对水解探针检测开发的RealMasterMix Probe 与针对SYBR Green 法和单重探针检测开发的 RealMasterMix 都不需要酶长时间的热激活。此外，极快的变温速度和极短的信号记录时间使定量 PCR 整体运行时间被大幅度的缩短，这些都是以往以Peltier 为基础的实时定量PCR 仪所无法实现的。 本文通过具体的实验结果验证了Eppendorf 实时定量 PCR 仪与试剂组成的定量 PCR 系统的优势，考察的指标包括：结果重 复性、检测范围、灵敏度、特异性、多重PCR 能力及运行速度。 以下实验均在 Mastercycler ep realplex 四通道银制模块荧光定量 PCR 仪上进行。在 SYBR Green I 方法的测试中，采用了 Eppendorf RealMasterMix 试剂。TaqMan 方法的测试中，采用的是 RealMasterMix Probe 试剂。PCR 反应体系是在 epMotion 5070 自动移液工作站上进行制备的。PCR 混合反应液分装于 Eppendorf twin.tec 96 孔群边 PCR 反应板中，并用 Eppendorf 热封仪和封膜进行封板。 表1 ：引物与探针 目标序列 引物/探针序列 Tm(℃) 终浓度 扩增大小 Forward primer: caggaactgaagaatgccagaga 63.0 TaqMan: 300 nM Reverse primer: ccgtcgagaatactggcaattt 62.5 104 bp Lambda genome Probes: FAM-tgtactttcgtgctgtcgcggatcg-TAMRA 72.8 TaqMan singleplex: 200 nM YY-tgtactttcgtgctgtcgcggatcg-BHQ1 Forward primer: