MTT法 及细胞凋亡检测.pptVIP

实验八 MTT法检测细胞相对存活率（教材95页） 细胞凋亡诱导分析检测技术（教材162页） MTT法检测细胞相对存活率（教材95页） 【方法与步骤】 （1）传代5×104个/100ml 人子宫颈癌细胞HeLa于96孔板， 37°C培养过夜； （2）每孔加入不同剂量的大蒜素（1、5、10 ml），每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照， 37°C培养0.5h； （3）于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37°C培养1h； （4）吸弃培养液，各孔加入100ml DMSO，振荡培养板， 37°C培养10min； （5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过与对照组比较得到实验组的存活率。 【结果与观察】 （1）加MTT后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的MTT被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫蓝色颗粒溶解； （2）各组OD值取平均值后，以下式计算存活细胞百分数： 存活细胞%=（OD实验/OD对照）×100% 对照组 实验组 1ul 10ul 1ul 5ul 10ul 1ul 5ul 第1组 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5ul 10ul 10ul 大蒜素 剂量 对照组 细胞凋亡诱导分析检测技术 Cell Death 细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，故坏死组织或细胞在苏木精/伊红染色切片中，胞质呈均一的深伊红色，原有的微细结构消失。在含水量高的细胞，可因胞质内水泡不断增大，并发生溶解，导致细胞结构完全消失，最后细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。 表15-2 细胞凋亡和细胞坏死的区别 区别点 细胞凋亡 细胞坏死 起因 生理或病理性 病理性变化或剧烈损伤 范围 单个散在细胞 大片组织或成群细胞 细胞膜 保持完整，一直到形成凋亡小体 破损 染色质 凝聚在核膜下呈半月状 呈絮状 细胞器 无明显变化 肿胀、内质网崩解 细胞体积 固缩变小 肿胀变大 凋亡小体 有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬 无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬 基因组DNA 有控降解，电泳图谱呈梯状 随机降解，电泳图谱呈涂抹状 蛋白质合成 有 无 调节过程 受基因调控 被动进行 炎症反应 无，不释放细胞内容物 有，释放内容物。 图左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体） Ho.33342与PI荧光双染显示凋亡与坏死细胞（教材168页） 【方法与步骤】 （1）传代5×104子宫颈癌细胞HeLa于含有盖玻片的24孔板， 37°C培养过夜； （2）每孔加入5ml的大蒜素，以药物溶剂作对照， 37°C培养0.5~1h； （3）加入PBS，洗细胞5min X 3次； （4）取出细胞爬片，加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避光放置30min； （5）加入PBS，洗细胞5min X 3次； （6）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片上，将爬片上的细胞面向下盖于碱性甘油中，避免产生气泡，树胶封固后荧光显微镜观察。 1 2 3 4 5 6 A B C D 1组 2组 3组 4 5 6 7 8 9 10 【结果与观察】 在紫外光激发下，HeLa正常细胞发出柔和的蓝色荧光，凋亡细胞细胞核发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞发红色荧光； 正常细胞核荧光均匀，而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝色荧光的凋亡小体。 * * * * * * * * * * * * * * * * * *