FSR的Ames试验研讨.pdf

FSR的Ames试验研究 丁克祥 唐非 海军抗衰老研究中1召(广州，510318) Ames试验是毒理学研究的重要内容，也是 目前国际上较为公认的快速筛选环境中 食物、保健品、药物是否致突变物的短期生物学试验方法之一。它利用鼠伤寒沙门氏菌 的组氨酸营养缺陷型菌株(His-)发生自发回变的特性，检测出受试物是否具有致突变 性，由此可以初筛并观测其是否具有潜在致癌性。为了从科学实验的角度证明FRS在临 床试用前对人体的安全性 本研究通过在不含组氨酸的平皿培养其中加人不同浓度的 FRS，然后，计数在该培养其上生长出的回变菌落数，现时计算诱变菌落数并进行计算，即 可判断出FRS有无致突变性，现将结果报告如下: 材 料 和 方 法 一、材料 (一)受试物:瓶装FRS，由作者提供。 (二)试验菌株:由美国加利福尼亚Smes试验室所提供。 (三)肝微粒体酶活化系统:由同济医科大学提供。 酶活化系统制备:选择健康的成年Wistar大鼠，每只休重200g左右，按照500mg/kg 体重一次腹腔注射多氯联苯，注射混合液用玉米油配制，浓度为200mg/tnl，注射后第五 天断头杀鼠。将断头处死的大鼠，以无菌操作取出肝脏，称重，计算湿肝重。然后，加入3 倍于肝湿生的0.15mol/L的KCL溶液，用无菌玻璃匀浆器制备肝匀浆。将制备好的肝 匀浆用低温(一4r-)高速离心(9000Xg)20分钟，取上清液分装，保存于一80℃低温冰箱 中备用。试验时，每个培养皿中应用S-9混合液量为0.5rnlo (四)平行对照物:每次试验均设阳性和阴性对照物。阳性对照物选用市售的已知致 癌物敌克松(Dexon)作为直接诱变物;2.7一二胺基作为间接诱变物，二甲基亚矾(DM- SO)作为阴性对照物。 (五)试验器材: 1、器材:平皿(90mm)、小试管(13x100mm)、三角烧瓶、量筒、吸管、称量瓶、高压锅、 干热灭菌箱、恒沮培养箱、冰箱、恒温摇床、混匀器、分析天平、722分光光度计、定量加样 器、紫外灯、高速冷冻离心机等。 2、药品和试剂:牛肉膏、蛋白膝、柠橡酸、NaCl,MgSO4.7H20,K2HP04,NaNH4一 HP0.4H20,葡萄糖一6一磷酸(G-6一P),MgC12-6H20,KC1,Na2HP04H20、结晶紫、 209 氨节青霉素、四环素、燕馏水等。 二、试验方法: (一)标本处理方法:将FRS用二甲基亚矾溶液稀释，配成如下浓度:1/50,1/200,1/ 500,1/2000,1;50000离心，过毖，除菌后再投人试验。 (二)试验菌液的制备方法:用无菌小勺挑取适盘的冻于菌种或直接由母板挑取适A 的菌落，接种于10rra营养肉汤培养基中接种后的培养液在37〔下振荡(120rpm),培养 10一12小时。菌掖浓度此时要求达到1一2x1护2湘，菌液浓度的判断可参照多次动菌计 算，并在650m 波长下侧其透光率，以其透光率作为菌掖浓度参数，当符合试验菌液的规 定要求后即可投入试验。 (三)操作方法:先在试验平皿上用记号笔作好标记。试验时，每种菌株、每个测试浓 度均应设里三个平皿重复试验，以确保结果的准确性。取其熔化的表层培养基，在40一 45℃条件下保沮15分钟。取表基一管，依次加人如下各种成分:试验菌液0.Iml,S一9 混合液0.5m1,受试物标本FRS的DMSO溶液和水溶液各0.1m1;在电动混合器上充分 混匀约3一5秒后，将表基迅速倾到在底层培养基上，便表层培养基均匀铺于底基上，置 于水平台上凝固。以上整个操作需要在20秒内完成，并注意避光。待表基冷凝后，置 371C沮箱中培养48小时后观察结果，侧试样品均也按此类方法进行。 (四)结果观察与判断:取出37C温箱中培养48小时的培养基平皿准确计数试验平 皿上回变菌落的数月，然后，计算每组数据的均致，凡诱变菌落数为自发回变菌落数的二 倍以上，且诱变作用呈现剂量— 效应关系时为阳性致突变物。本研究以MR二诱变菌 落数(Rt)/自发回变菌落数(Rc)。凡MR2，则Ames试验为阳性，凡MR2，则Ames 试验为阴性。