第三节聚合酶链反应的原理和应用.pptVIP

第三节 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR） PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。 体外程序化的DNA合成技术。 PCR 原 理： 1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 2）反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer 3）反应程序： 变性94~95oC 复性 延伸 37~55 oC 70~72 oC 72 oC延伸10min DNA扩增100万倍 PCR扩增 PCR特点及应用： 特点：（1）特异性强，灵敏度高，稳定可靠，快 速； 2）微量的模板DNA即可扩增大量产物; 应用：（1）基因组DNA分析； （2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断; 缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。 PCR相关技术： 1.增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。 2. 巢式PCR（nest PCR） 　　　此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。 　　　除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。 在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。 4.RT-PCR RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。 RT-PCR RT-PCR 五、单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP） 　是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。 通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。 在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。 PCR-SSCP过程： --------------------------- primer --------------------------- ↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ? ↓ 1 2 3 4 5 自显影 ↓