第三节载体-基因工程.ppt

第三节 载体 一．载体的概念： 1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2.凡来源于质粒或噬菌体的DNA分子，可以插入或克隆DNA片段统称为vector。 3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA ; 二、载体的分类;三、基因工程载体的3个特点： （一）能独立自主的复制 载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，如MCS，插在其中的外源DNA片段，能被动的跟着载体一起复制/扩增，就像载体的正常成分一样。 （二）能便利的加以检测 如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因，将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的???体分子的受体细胞才能存活。 （三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。 ;四 载体举例介绍;1. 质粒载体: (1) 染色体外的双链环状DNA分子 (2)大小为1～200kb； (３)能独立于染色体外进行自我复制，每个细胞中 可含10～200个拷贝。 (4)分高拷贝数和低拷贝数质粒或窄宿主范围和广宿 主范围 (5)质粒包含：复制起始区、选择标记基因和限制性 核酸内切酶的酶切位点 常用质粒有：pBR322、pUC19 质粒的不相容性：同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象 ;Ampr→;入-噬菌体 DNA长度约为48.5kb(分子量3.2×107) 在病毒颗粒中为双链线形分子 具有12bp的粘性末端(cohesive end )，进入大肠杆菌之 后立即互补成环。 Cos 位点：当λDNA进入细菌细胞后，便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子，这种黏性末端结合形成双链的区域称为cos位点。 ; λ-噬菌体结构特点： 1、野生型为48.5kb，两端带有12碱基的单链粘性末端，进入 大肠杆菌后环化，既可溶菌又可溶原生长。 2、基因组分为三个区域：左侧区包括使噬菌体成熟的全部基 因；中间区不是病毒生活必需的，外源DNA片段往往插入 此区；右侧区包括所有的主要调控成分。 3、λ-噬菌体基因组中只有60%是溶菌生长必需的，作为克 隆载体时，可插入9~23kb的外源DNA片段。 ;;λ重组分子的选择主要有下面几种方法。 　　① cI基因功能选择-- cI基因编码的阻遏蛋白可使感染了λ噬菌体的大肠杆菌进入溶原化状态。如果在插入型载体的克隆位点上，或是置换型载体的可置换片段中，放上一个cI基因，当外源DNA插入或取代时，便破坏了cI基因，使出现cI-表型。此时，λ重组分子生成的是透亮的噬菌斑，而未重组的λ噬菌体由于仍保有cI基因，所以宿主细菌是溶原化的，就生成混沌的噬菌斑。  　;　②lac Z基因功能选择---- lacZ基因的产物为乳糖苷酶，在Xgal—IPTG培养基上显现蓝色。在插入型载体的lac Z基因序列中引入限制性内切核酸酶的切点，外源DNA插入这个克隆位点就会破坏lac Z基因，于是在上述培养基上出现无色的噬菌斑。如果没有同外源DNA形成λ重组分子，则lac Z基因未遭破坏，在培养基上出现蓝色的噬菌斑。 ③spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就不能正常生长。 ;3.柯氏质粒／粘尾质粒(cosmid) 定义: 含有入噬菌体粘性末端的复合质粒。 由入-DNA c o s区与质粒重组建造而成. 在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。 ;柯氏质粒特点;大肠杆菌载体;　特点： ;酵母载体类型：;整合型载体（YIP）;复制型载体（YRP）;附加体型载体（YEP）