质粒制备绝对定量PCR标准曲线方法的建立精选.pdfVIP

农业生物技术学报，2011年，第19卷，第6期，第1157～1162页 Journal ofAgriculturalBiotechnology，2011，V01．19，No．6，1157-1162 技术改进 Technology Updated 质粒制备绝对定量PCR标准曲线方法的建立 李丽赵成萍 李宏 李武峰 张利环 许冬梅 王金胜 李惹锋+ 山西农业大学生命科学学院，太谷030801 +通讯作者，lihuifengtom@yahoo．com．cn 摘 要用质粒制备绝对定量PCR标准曲线存在着作为标准品的双链环状质粒分子与待测样品单链线性 eDNA分子结构不一致的问题。为了消除二者之间的差异，确保绝对定量PCR测定方法的准确性，我们在用质 粒制备标准曲线和测定未知样品中特定基因mRNA分子拷贝数时进行了两个改进：1)用酶切的方法使环状质 粒线性化，用线性质粒制备标准曲线；2)将未知样品eDNA扩增出一条正义链，再与作为标准曲线的质粒标准 品同时开始荧光定量PCR循环。实验结果表明，1)具有相同拷贝数的环状和线性质粒在一起进行定量PCR测 出的起始拷贝数均大于未先扩增一次的测定结果。样品起始拷贝数两次测定结果的差异分析表明5个样品中 线能够准确地反应目的产物扩增。经改进的质粒制备绝对定量PCR标准曲线的方法更为简便易行，并提高了 测定的准确性。 关键词质粒，标准曲线，绝对定量PCR of for EstablishmentthePlasmidStandardCurveGenerationMethod Absolute PCR Quantification LiLi Zhao Li Li LihuanXu ChengpingHongWufengZhang DongmeiWangJinshengLiHuifeng+ Shanxi ofLife AgriculturalUniversity，CollegeSciences，Taigu030801，China +Correspondingauthor，lihuifengtorN@yahoo．corn．cn ’ DOI：10．3969，j．issn，1674-7968．2011．06．024 Abstract vectortobuildstandardcurveforabsolute induce Usingplasmid quantificationPCR(AQ—PCR)might errorbecauseofthemoleculardifferencebetween double·-strandDNAandlinear super--helix plasmid single-·strand eDNA increasetheexactitudeofthe two the sample．To AQ—PCR，weimprovedthe,methodbyaddingstepsduring of mRNAinunknown was tobe quantityassayprocessiontargetgene copy samples．1)Theplasmiddigested for unknown were tomake linearrestriction standard eDNA enzymes curve；2)The