动物血液原虫病病原检查技术.doc

动物血液原虫病病原检查技术 一、实验目的要求 掌握动物血液原虫病的血液涂片技术和染色方法；正确判断各种常见血液原虫的形态特点。 二、实验器材 （一）仪器设备 生物显微镜（带油镜镜头）、载玻片、注射针头、剪刀、染色缸 （二）试剂 姬姆萨氏染料、甘油、甲醇、香柏油 （三）实验动物 鸡 （四）示教标本 伊氏锥虫 双芽巴贝斯虫 环形泰勒虫 卡氏住白细胞虫 沙氏住白细胞虫 三、实验方法、步骤和操作要领 （一）姬姆萨氏染色液的配制 1．姬姆萨氏染色液原液配方。 姬姆萨氏染色粉 0.5g 中性纯甘油 25ml 无水中性甲醇 25ml 姬姆萨氏染色液原液配制过程。 （1）先将姬姆萨氏染色粉置研钵中，加少量甘油充分研磨，再加甘油再研磨，直至甘油全部加完为止。将其倒入棕色小口试剂瓶中，在研钵中加入少量甲醇以冲洗甘油染液，冲洗液仍倒入上述瓶中，再加甲醇再洗再倒入，直至25 ml甲醇全部用完为止。 （2）塞紧瓶盖，充分摇匀，而后将瓶置于65℃温箱中24h或室温3～5d，并不时摇动，然后过滤到棕色小口试剂瓶中，即为原液。 （二）血液涂片的制作及染色 1．血液涂片的制作。 （1）薄片法（适合于观察红细胞内虫体，如巴贝斯虫）。 ① 用消毒注射针头刺破鸡的翅下静脉。 ② 用洁净载玻片的一端，从鸡的翅下静脉穿刺处接触血滴表面，蘸取少量血液。 ③ 另取一块边缘光滑的载玻片，作为推片。先将此推片的一端置于血滴的前方，然后稍向后移，触及血滴，使血液均匀分布于两玻片之间，形成一线。 ④ 推片载玻片与血片载玻片成30～45°角，平稳地向前推进，使血液接触面散布均匀，即成薄的血片。 ⑤ 抹片完成后，立即置流动空气中干燥，以防血球皱缩或破裂，并加甲醇固定，待干。 （2）厚滴法（适合于观察血浆内虫体，如伊氏锥虫）。 ① 取血液1～2滴置洁净载玻片上。 ② 用另一块载玻片之角，将血滴涂散至直径1cm即可。 ③ 置室温中待其自行干燥(至少经1h之久，否则血膜附着不牢，染色时易脱)。 ④ 染色前先将血片置于蒸馏水中，使红细胞溶解，血红蛋白脱落，血膜呈灰白色为止，再进行染色。 2．血液涂片的染色过程。 （1）血片用甲醇固定2 min。 （2）将血片浸于用10份蒸馏水加1份染液稀释的染色液缸中30 min (过夜最好)。或将蒸馏水与染液按2∶1稀释好的染色液直接滴加于血片上，染色10 min 。 （3）血片取出后，用洁净的水冲洗。待干镜检。 附：血液涂片的制作及染色流程图。（图16-1） 四、实验注意事项 1．配制染色液时姬姆萨氏染料必须充分研磨。 2．采血前先用酒精棉消毒待干，以免皮屑污染血片和酒精溶血。 3．取血滴时必须在针头刺破后流出的表层血液用玻片迅速蘸取，以免血液凝固。 4．注意在病畜出现高温期，未作药物处理前采血，以提高虫体检出率。 5．涂片时血膜不宜过厚，使红细胞均匀分布于玻片上。 6．血片必须充分干燥后再用甲醇固定，以免血膜脱落。 五、实验报告 如何制作染色效果好且无杂质污染的血液涂片？试作分析、阐述。 附：参考资料 1． （1）伊氏锥虫。伊氏锥虫寄生于动物血浆内，虫体呈纺锤或柳叶状，体长18～24μm，宽1～2μm。前端比后端更尖。经姬姆萨染色后，虫体呈淡蓝色。在显微镜下可看见下列几部分构造：① 原生质：浅蓝色部分。② 核：在虫体中部呈紫红色椭圆形。③ 副基体：在虫体后端呈紫红色的小圆点。④ 波动膜：在虫体的一侧呈波状。⑤ 鞭毛：在虫体后端，从付基体附近的毛基体开始围绕波动膜边缘，直到虫体的前端游离，呈细长鞭毛状。（图16-2、图16-3） （2）双芽巴贝斯虫。双芽巴贝斯虫寄生在红细胞内。虫体较大，有梨形、环形、椭圆形、变形虫形等。典型虫体呈双梨形，细的一端联在一起成锐角排列。虫体大于红细胞半径，经姬姆萨染色后，原生质浅蓝色，边缘较深，有二团紫红色的染色质。（图16-4） （3）环形泰勒虫。环形泰勒虫寄生在牛的淋巴细胞、巨噬细胞及红细胞内。 配子体呈小环形，短棒状或逗点状。在每个红细胞中通常有1～5个虫体，大小为0.7～2.9μm，染色后原生质呈浅蓝色，染色质呈紫红色。（图16-5） 裂殖体，又称石榴体，有不同形状和大小，存在于淋细胞的胞浆中或淋巴液中。通常可看到浅蓝色的原生质背景上有暗紫色数目不等的染色质核。（图16-6） 2．家禽常见血液原虫的形态特征描述。 （1）卡氏住白细胞虫。卡氏住白细胞虫配子体寄生在鸡的血细胞内。 配子体刚侵入红细胞时呈圆点状或逗点，每个红细胞