分子生物学基因工程实验讲义.doc

徐州工程学院《分子生物学与基因工程实验》自编讲义 发布时间： 2011-11-18 11:00:00 编写：高兆建 ?2010年10月 ? 目?录 实验一?细菌基因组提取 实验二?目的基因的克隆 实验三?质粒载体的制备 实验四?基因及质粒载体的酶切及鉴定 实验五?大肠杆菌感受态细胞的制备 实验六?目的基因同载体的连接、转化及鉴定 ? 实验一? 细菌基因组提取 一、实验目的 1.学习并掌握细菌基因组的提取方法 二、实验原理 DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质