三叶木通MSAP反应体系的优化及引物筛选.PDFVIP

• 572 • 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 3 期 2012 年 3 月 三叶木通 MSAP 反应体系的优化及引物筛选 1 1, 2, 3* 1 1 1 1, 2, 3 高 寰 ，张 铮 ，周 婷 ，曹向然 ，陈阳洋 ，王之 1. 陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062 2. 陕西师范大学 药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西 西安 710062 3. 西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西 西安 710062 摘 要：目的 研究三叶木通表观遗传多样性，建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism ，MSAP ）反应体系。方法 以三叶木通叶片为材料，利用正交试验建立三叶木通MSAP 的预扩增和选择性扩 增的最佳反应体系。结果 建立的 MSAP 最佳反应体系为酶切反应：HpaII/MspI 10 U ，EcoR I 10 U ；预扩增反应：总体积 20 μL ，连接产物2 μL ，E00 、HM00 各 125 ng，dNTPs 0.312 5 mmol/L，Mg2＋ 1.875 mmol/L ，Taq DNA 聚合酶 2 U ；选择性 扩增反应：总体积 20 μL ，稀释 200 倍的预扩增产物 5 μL ，引物 E-ACT 、HM-CAT 各 50 ng，dNTPs 0.250 mmol/L，Mg2＋ 1.250 mmol/L ，Taq DNA 酶 1 U。利用优化的体系，最终从MSAP 的 80 对引物中筛选出有效引物 6 对。结论 建立的 MSAP 反应 体系可用于后续三叶木通 DNA 甲基化的相关研究。 关键词：三叶木通；MSAP ；遗传多样性；体系优化；引物筛选；酶切反应 中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)03 - 0572 - 05 Optimization of MSAP reaction system for Akebia trifoliata and primers screening 1 1, 2, 3 1 1 1 1, 2, 3 GAO Huan , ZHANG Zheng , ZHOU Ting , CAO Xiang-ran , CHEN Yang-yang , WANG Zhe-zhi 1. College of Life Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China 2. Key Laboratory of Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, Ministry of Education, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China 3. National Engineering Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China, Xi’an 710062, China Abstract: Objective To establish and optimize the MSAP reaction system for analysis on epigenetic diversity in Akebia trifoliata . 5 Methods The leaves of A. trifoliata were as materials, using orthogonal L16(4 ) method to establ