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分子克隆 工具酶（Tool Enzyme） 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 T4多核苷酸激酶 功能：催化γ-磷酸从ATP分子转移给DNA的5`-OH末端（图）。 用途： （1）标记DNA的5`-末端； （2）使缺失5`-P末端的DNA发生磷酸化作用。 核酸酶S1 核酸酶S1可水解双链DNA，RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分，其作用是除去双链DNA的黏性末端以产生平末端，除去cDNA合成时形成的发夹结构。 多克隆位点（Multiple Cloning Sites,MCS）:载体上多个限制酶的单一切点(即在载体的其他部位没有这些酶的相同切点)。 3. 含有多个限制性内切酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。 （四）酵母细胞中克隆基因常用载体 YIP和YCP载体能稳定遗传，但是为单拷贝转化率低，多用于遗传分析。 YRP和YEP载体稳定性差，但是对酵母具有较高的转化活性，拷贝数高，YEP被用于基因克隆中的常用载体。 (五)动物细胞基因克隆的载体 类型:猿猴空泡病毒40(SV40)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体。 （一）原核细胞表达载体 原核细胞的表达载体主要是 大肠杆菌表达载体。 外源基因在原核细胞中的表达载体可以分成三种类型 3. 融合蛋白表达载体 （二）哺乳动物细胞表达载体  人工构建的既带有原核细胞的复制元件 、又带有真核细胞的复制元件，既能在原核细胞中复制、又能在真核细胞中复制，在原核和真核细胞分子克隆中均能应用的载体，称为穿梭载体（shuttle vector）。 （一）目的基因的获取（isolation） 1. 化学合成法（人工合成DNA片段） 2.逆转录合成cDNA 3. 从文库中获取 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 4. 直接从染色体DNA中分离目的基因 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 3. 从基因文库中获取 蓝菌落 蓝白菌落 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 目 录 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 * 从cDNA文库获取目的基因 目 录 4.直接从染色体DNA中分离 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 二、克隆载体的选择和构建 Digestion 三、目的基因与载体的连接 Ligation Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 目 录 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 目 录 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 目 录 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外