C14DNA的生物合成.pptVIP

分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 试管内合成cDNA: cDNA ?complementary DNA? 逆转录酶 A AA A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 二、逆转录的发现发展了中心法则 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。 三、真核生物线粒体DNA按D环方式复制 dNTP DNA-pol γ D环复制(D-loop replication) 是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。 三、真核生物线粒体DNA按D环方式复制 D-环复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。 D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。 * 真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等； DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶?/?转换； 切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse HⅠ和FEN1等。 真核生物与原核生物DNA复制的差异： 哺乳动物的细胞周期 DNA合成期 G1 G2 S M 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol α（引物酶活性）和pol δ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 一、真核生物复制的起始与原核基本相似 酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）： 酵母染色体含有多个复制起点。 元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白质复合物──复制起点识别复合物(ORC)。 3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同。 酵母复制起始点 增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物－模板链；并且PCNA使polδ获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。 拓扑异构酶，去除负超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除复制叉前方产生的正超螺旋 TolⅠ和TolⅡ DNA双螺旋解链，参与组装引发体 DNA解旋酶 连接冈崎片段 DNA连接酶Ⅰ 核酸酶，切除RNA引物 RNAse HⅠ 核酸酶，切除RNA引物 FEN1 DNA复制，核苷酸切除修复，碱基切除修复 Pol ?/? 合成RNA-DNA引物 Pol ?/引发酶 有依赖DNA的ATPase活性，结合于引物-模板链，激活DNA聚合酶， 促使PCNA结合于引物-模板链 RFC 激活DNA聚合酶和RFC的ATPase活性 PCNA 单链DNA结合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易结合DNA RPA 功 能 蛋白质 真核DNA复制叉主要蛋白质的功能 DNA-pol δ和pol α分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol δ通过PCNA的协同作用，逐步取代pol α，在RNA引物的3?-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol α催化合成。然后由PCNA协同，pol δ置换pol α，继续合成DNA子链。 二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶α/δ转换 前导链：出现在引发后期 后随链：发生于每个冈崎片段合成之际 发生DNA聚合酶?/?转换的原因是Pol ?不具备持续合成能力。 DNA聚合酶?/?转换的关键蛋白是RFC。 DNA聚合酶?/?转换 真核DNA聚合酶转换和后随链合成 3? 5? 5? 3? 领头链 3? 5? 3? 5? 亲代DNA 后随链 引物 核小体 三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两