人参三七提取物促血管生成的信号转导机制研究田伟PPT.ppt

* * 人参三七提取物促血管生成的信号转导机制研究 田伟 雷燕 朱凌群 陈可冀 中国中医科学院西苑医院 北京中医药大学东直门医院 研究背景 益气活血中药治疗冠心病取得较好疗效，促血管生成可能是的重要机制之一 前期研究发现益气活血中药有促进血管生成、改善心肌缺血，增强血管内皮细胞增殖与迁移的作用，但其信号转导机制和作用靶标？ 研究背景 细胞信号通路是细胞应答内外环境信息，经信号网络整合作用调节基因表达及细胞增殖、分化、发育的途径。细胞的增殖、分化主要与有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径有关。Ras是调节细胞生长的重要转导蛋白，通过Ras-Raf-MAPK最后产生级联反应 观察人参三七提取物对血管内皮细胞血管生成信号蛋白的作用，以阐明益气活血药促血管生成信号转导途径 血管生成的过程 外因 —— 活化邻近的血管内皮细胞 血管内皮细胞分泌蛋白酶降解基底膜及细胞外基质 血管内皮细胞增生 血管内皮细胞改组形成小管，随后吻合成网状并注入血流 研究思路 中药促进内皮细胞增殖 信号转导机制 中药作用靶点 血管生成信号通路 VEGF VEGFR-2 Ras MAPK 信号阻断 VEGFR-2 Ras 24h内皮细胞增殖直方图 人参三七提取物 配比：2：1 浓度 ：4mg/ml 时间：培养24h HUVEC增殖作用最强 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 人参：三七(1:1) 人参：三七(1:2) 人参：三七(2:1) 空白对照组 0.25mg/mL 0.5mg/mL 1mg/mL 2mg/mL 4mg/mL MTT 实验2 人参三七提取物促VEC增殖 和分泌VEGF 实验分为5组 MTT 检测各组细胞增殖 ELISA 检测上清VEGF含量 人参、三七能够促进HUVEC增殖和分泌VEGF 实验3 人参三七提取物促VEC上VEGFR-2表达 免疫组化－SP法 阳性细胞光密度 阳性细胞数 人参、三七能促进VEGFR-2的表达，其作用和bFGF相当 实验4 人参三七提取物对血管生成 信号蛋白及其mRNA的影响 检测血管生成信号通路上VEGFR-2、Ras、 MAPK 蛋白及其mRNA表达 探讨益气活血中药干预后，对血管生成信号蛋白VEGFR-2、Ras、MAPK表达的影响 方法：western blotting ;RT-PCR 信号蛋白VEGFR-2 、Ras、 MAPK蛋白及其mRNA的表达 A B C D E A B C D E 21kD β-actin VEGFR-2 β-actin Ras A 空白组；B bFGF组；C 中药大剂量组；D 中药中剂量组；E 中药小剂量组 各组 VEGFR-2 蛋白的表达 各组 Ras 蛋白表达比较 43 kD 43 kD 215 kD β-actin MAPK 43 kD 46 kD 各组MAPK蛋白表达条带 A B C D E 表1 各组蛋白免疫印迹杂交信号强度 灰度平均值比较 (n=3) , 组别 VEGFR-2/β-actin Ras/β-actin MAPK/β-actin 空白对照 1.58±0.102 0.28±0.001 0.38±.0110 bFGF组 2.11±0.211Δ 0.42±0.017Δ 0.58±.0206ΔΔ 中药大剂量 2.07±0.189Δ 0.53±0.237ΔΔ 0.45±.0299 中药中剂量 1.48±0.173 0.34±0.029 0.38±.0215 中药小剂量 1.39±0.261 0.49±0.028ΔΔ 0.48±.0142Δ 注：与空白组比较，Δ P＜0.05；Δ ΔP0.01 血管生成信号蛋白MARK及其-mRNA的表达 结果和结论 与空白组相比，中药大剂量组VEGFR-2、Ras 蛋白表达明显增强，小剂量组MAPK、Ras蛋白表达明显上调。bFGF组VEGFR-2、Ras、MAPK的表达显著增强，差异均有统计学意义（P0.05～P0.01） 人参、三七可促进血管生成信号蛋白 VEGFR-2 Ras MAPK的表达 可能是益气活血药促内皮增殖，产生血管生成效应的基础 以上三个信号蛋白的mRNA表达未见增加 实验5 SU5416阻断对VEGFR-2下游 信号蛋白的影响及中药干预 目的：观察下游信号蛋白 Ras/MAPK表达，明确中药 作用靶点 方法：加入半数抑制量的SU5416，对信号通路关键蛋白 VEGFR-2进行 IC50 阻断，中