9章 电泳和电色谱.doc

章 节 第九章 电泳和电色谱 2学时 学习目的和 教学要求 1．了解电泳速度 2．掌握凝胶电泳、不连续凝胶电泳 3．理解等电点聚焦、二维电泳、逆向作用层析电泳、毛细管电泳 4．掌握连续电泳操作 教 学 重 点 难 点 重点：凝胶电泳、不连续凝胶电泳 难点：等电点聚焦、逆向作用层析电泳 教学进程（含章节教学内容、学时分配、教学方法、辅助手段） 电泳的概念 电泳的基本原理 电泳技术的分类 基本的电泳系统组成 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理 SDS PAGE的分离原理 何谓等电聚焦？如何形成载体两性电解质pH梯度？ 何谓双相电泳？其作用是什么？ 第一节 基础理论 第二节 凝胶电泳 第三节 等电点聚焦 第四节 二维电泳 第五节 逆向色谱 第六节 毛细管电泳和电色谱 第七节 连续电泳和电色谱 主要参考资料 《生物分离工程》孙彦主编，化工出版社，2004 《生物分离工程》第二版，孙彦主编，化工出版社，2007 《现代生物分离工程》，曹学君主编，华东理工大学出版社，2007 备 注 多媒体教室 第九章 电泳和电色谱 9.1 基础理论 一、电泳概念 电泳是荷电溶质（电解质）或粒子在电场作用下发生定向泳动现象。电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。 二、电泳的原理 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。 1. Stoke’s Law（斯托克斯定律） 如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Z和电位梯度E，它们与介质的摩擦阻力f相抗衡，这种抗衡服从斯托克斯定律： f = 6πrηve f 溶质在溶液中所受的黏性阻力 r 球形溶质的半径 η 溶液的黏度 ve 溶质的运动速度 但实际情况中， f 还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至是介质的内渗等。 2. 电解质溶质的迁移率（电泳迁移率） u0：电解质溶质的迁移率 Z：溶质的荷电荷数 r: 溶质的半径 ? η：溶液黏度 e：电子电量=1.6×10-19C 电解质溶质的迁移率与电场强度成正比，与粒子电荷成正比，与颗粒半径成反比，与介质黏度成反比。 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础 三、电泳的分类 根据载体：纸电泳、膜电泳、凝胶电泳 根据电场强度：常压电泳（600V以下）、高压电泳（600V以上） 根据电场方向：平板电泳、垂直板电泳 依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系统 （1）移动界面电泳（moving boundary electrophoresis） （2）区带电泳（zone electrophoresis ） （3）稳态电泳（steady state electrophoresis ） 其中以区带电泳为目前常用的电泳系统。 四、区带电泳的主要技术 具有支持介质的区带电泳，能够防止电泳过程中的对流和扩散，可使被分离的成分得到最大分辨率的分离； 区带电泳中的常用技术 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳 9.2 凝胶电泳 一、凝胶电泳 凝胶电泳(gel elecrtophoresis)区带电泳分离方法，主要利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离。在凝胶电泳过程中，相对分子质量大的溶质受凝胶阻滞作用大，电泳速度慢，而相对分子质量小的溶质的电泳速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成含有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离。 1. 板式凝胶电泳（生化实验室用，不适于分离制备） 2. 柱式凝胶电泳（以制备为目的） 图P367，凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一,最基本的凝胶电泳法。 3. 不连续凝胶电泳 图P367 不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成，上层凝胶浓度较低(丙烯酰胺质量分数Tg=2％~3％)，孔径较大，凝胶对溶质的泳动无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩；下层凝胶浓度较高(Tg=5％~25％)，各个组分根据其在凝胶中迁移率的差别得到分离。一般上层凝胶称为浓缩层，下层凝胶称为分离层。在上层凝胶中溶质以等速电泳的形式被动，得到浓缩。 4. 电泳支持介质必须具有的特性： 化学惰性