河北师大微生物实验五.ppt

LOGO  实验五 从土壤中分离纯化放线菌 一、实验目的 1. 掌握配制培养基的原则和方法。 2. 掌握微生物分离和纯化的原理和 方法。 二、实验原理 1. 微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。方法主要有：简易单细胞挑取法和平板分离法。 2. 土壤是微生物生活的大本营，是发掘微生物资源的重要基地！放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。 3. 放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌。 4. 涂布平板法：将含有各种微生物的土壤悬液稀释不同倍数后，涂布接种到平板培养基上，在适宜条件下培养，从中选取放线菌，接种到斜面培养基上进行培养。 三、实验材料 1. 培养基：高氏I号培养基。 2. 样品：花园2 cm深土壤。 3. 仪器及其他用品：酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、滴管、试管、培养皿、锥形瓶、枪头、涂布器等。 四、实验步骤 1. 高氏I号培养基的配制及分装 2. 物品准备 3. 灭菌 4. 铺试管斜面，倒平板 5. 分离 6. 放线菌纯化 7. 形态观察 1. 高氏I号培养基的配制及分装(五组) 高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。 （1）配方： 可溶性淀粉 40 g， NaCl 1 g， KNO3 1 g， K2HPO4 1 g， MgSO4 1 g， FeSO4 2 mL， 琼脂 40 g， H2O 2000 mL， pH 7.2～7.4 （2）在锅内加入一定体积水后加入可溶性淀粉，加热溶解后，加入无机盐，待水沸腾后，减小火力，加入琼脂粉，溶融后，定容至所需体积。调 pH值。（注意：加入琼脂粉后，注意搅拌，勿煮糊。）配1.7 L培养基。 分装：将上述所制溶液分装入500 mL锥形瓶中，250 mL/瓶，共5瓶；共1250 mL。 10 mL左右/试管，共42管，共420 mL，7个试管一捆（6捆）。 1. 高氏I号培养基的配制及分装(五组) 2. 物品准备（分组进行） 盛有9 mL水的试管，6支（试管用棉塞塞住） 在容积为250 mL的三角瓶内加入玻璃珠，以盖住瓶底为宜（作用：打散土壤结块），再加入90 mL蒸馏水，1瓶 试管斜面 8支（每组准备好试管和棉塞，第五组准备培养基） 平板9个 （5个/包，共9包） 1 mL枪头盒，1盒 涂布器8支 3. 灭菌 将上述培养基和准备的物品于121oC，20~30 min高压蒸汽灭菌。 4. 铺试管斜面，倒平板 1. 将42根装有培养基的试管斜放，制成斜面培养基。 2. 倒平板，每个梯度要有一个平行，要有空白对照。 5. 分离 注意：以下各分离步骤均在无菌条件下进行（无菌操作）。 （1）称取土壤样品10 g，倒入含有90 mL水和玻璃珠的三角瓶中振荡5 min，使土样充分打散。（注意：等水冷却了再倒入土样。） （2）无菌条件下，将土壤悬液稀释成10-2~10-7系列浓度。 具体稀释过程：用无菌吸管无菌操作取10-1浓度的土壤悬液1 mL并加入编号10-2的无菌试管中，震荡混合均匀。即为10-2浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-7的试管中（每个稀释度换1支枪头）。 （3）分别用移液器精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0.2 ~0.3 mL，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小的梯度开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。 （4）将上述所涂平板置于28～30 ℃温度下，倒置培养一周。 6. 放线菌纯化 (1)肉眼观察确认放线菌的菌落。怎么确认？ (2)在无菌条件下，挑取单菌落的孢子“之”字划线于试管的斜面上。 (3)将试管置于28～30oC的培养箱中培养一周。 7. 形态观察 （1）直接观察（同霉菌）：在培养基中，整体观察放线菌的菌落特征及其颜色。 （2）印片观察：取一小块带培养基的菌落正放于载玻片上，然后用另一载玻片加热后按压，注意不要滑动玻片。取上面的印片，有印迹的一面朝上，在40x物镜下观察。如需染色，先将有印迹的载玻片通过火焰2～3次固定，再用美蓝染色观察（染色1 min，水洗，干燥后观察）。 干燥、不透明、表面呈致密的丝绒状，上有一薄层彩色的“干粉” 菌落和培养基的连接紧密，难以挑取 菌落正反面颜色常不