肿瘤相关抗原MAGE- A 1, A2, A3, A4在原发性肝癌组织中表达的研究.docVIP

精品论文 参考文献 肿瘤相关抗原MAGE- A 1, A2, A3, A4在原发性肝癌组织中表达的研究 游泳 孙巍 石刚 朱兴 宋铎 　　（沈阳市第四人民医院肝胆外科 辽宁沈阳 110031） 　　【摘要】目的 研究黑色素瘤抗原MAGE-A1,A2,A3,A4基因在原发性肝癌(HCC)组织中的表达，探讨MAGE- A1, A2, A3, A4基因与HCC患者临床指标的关系。方法RT-PCR方法检测30例HCC患者癌组织及相应癌旁组织MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达。结果 30例HCC患者癌组织中MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达的阳性率分别为40%，13%，47%和17%显著高于癌旁组织(0) (Plt;0.01)。统计学分析显示 HCC患者癌组织中MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达的阳性率与患者性别、年龄、有无包膜以及乙型肝炎病毒感染等指标均无关(Pgt;0.05)；MAGE-A1和MAGE-A3的表达与肿瘤大小及AFP水平均存在相关性(Plt;0.05 )。结论MAGE-A1,A3在HCC中特异性高表达，可以用于HCC的免疫治疗。 　　【关键词】肝癌 黑色素瘤抗原基因 逆转录聚合酶链反应 　　【中图分类号】R730.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）16-0221-02 　　黑色素瘤抗原(MAGE)基因编码肿瘤相关抗原，可被自身特异性杀伤性T淋巴细胞识别，应用MAGE基因的这一特性制备抗原肽疫苗，用于多种恶性肿瘤的预防和治疗[1,2]。我们应用RT-PCR法对MAGE-A1，A2，A3，A4基因在HCC中的表达进行检测，为利用MAGE基因对HCC患者免疫治疗提供理论依据。 　　材料与方法 　　1材料 　　1.1 组织标本 对象选取2011年1月-2013年6月沈阳市第四人民医院肝胆外科收治的HCC患者30例，伴有乙型肝炎病毒阳性26例。其中男女比例为2: 3，年龄38-72岁，平均56.3岁。全部患者均行手术完整切除病灶，并经术后病理证实，切缘均阴性。病灶切除后，先距肿瘤边缘3 cm以外切取癌旁组织，再取癌组织，分别切成直径约1cm的小块，-80℃冻存备用。另取正常的睾丸组织(沈阳市第四人民医院病理科)作为阳性对照。 　　1. 2 引物 根据Genbank数据库中所查MAGE-A1，A2，A3，A4基因序列，使用Omiga 2软件设计引物(表1)。 　　表1 MAGE- A1，A2，A3，A4基因mRNA RT- PCR引物 　　注:F表示上游引物，R表示下游引物 　　1.3 试剂Trizol试剂购自美国Gibco公司，脱氧核苷酸（dNTPs)购自Pharmacia公司,RNA逆转录酶(MMLV)和TaqDNA聚合酶购自Promega公司。 　　2 方法 　　2.1 总RNA提取 取100 mg在-80 ℃保存的组织，于液氮中研成碎末后，迅速加入Trizol试剂1 ml裂解，经三氯甲烷分层、异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤干燥后，将所得RNA溶于无RNA酶的纯水中，采用紫外分光光度计(Beckman公司.1DU 640)对其定量后再分别进行cDNA合成和RNA电泳。 　　2.2 cDNA合成 稀释RNA至lmu;g/mu;L,逆转录合成cDNA (25mu;L反应体系):按试剂盒操作说明进行,37℃反应1.5h，94℃灭活6min，得到cDNA。 　　2.3 RT-PCR 2mu;L cDNA在各自引物引导下分别PCR扩增(25mu;L反应体系): 加 17mu;L双蒸水、2.5mu;L 10 times;buffer、1.5mu;L MgCL2、1mu;L dNTPs 、lmu;L引物、0. 1mu;L Taq酶。循环参数为94℃变性45s, 55℃退火45s, 72℃延伸60s,35个循环后72℃延伸5 min。MAGE- A3退火用54℃, MAGE-A1，A2, A4均为63℃。每次反应都用beta;-actin作阳性内参照，用正常睾丸做阳性外参照。5mu;L PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，Kodak凝胶图像分析系统摄图片。 　　2.4 肝炎病毒、AFP检测 本实验采用ELISA方法检测乙肝病毒表面抗原、AFP水平。 　　2.5统计学方法 使用SPSS 10.0软件建立数据库,chi;2检验和四格表确切概率法，设Plt; 0.05表示其差异具有统计学意义。 　　结果 　　1.1 MAGE基因在HCC中的表达情况 　　RT-PCR电泳显示：所有内参照均为阳性。阳性对照的MAGE带显示良好.而空白对照均无任何背景。癌旁组织中均未检测到MAGE-