冷应激仔猪淋巴细胞HSP70 mRNA定量研讨.pdfVIP

2006学术年会 冷应激仔猪淋巴细胞HSP70mRNA定量研究’ 杨焕民“ 计红1吴永魁2胡仲明“‘ 李士泽1李鹏1 (1．黑龙汪八一农垦大学黑龙江大庆163319；2．军事医学科学院兽医研究所吉林长春130000) 摘要：[目的]测定冷应激前后不同时间仔猪血液淋巴细胞中HSFT0mRNA拷贝数，探讨冷应激时仔猪血液淋巴细胞 升高(P0．05)。冷应激3h。转录量下降但冷应教6h稍微上升。HSPT0mRNA丰度在应激6h上升到一定程度后呈不断下 降的趋势。直到应激恢复3h，转录量呈上升趋势，到应激恢复24h，已经达到峰值．到48h下降到基础量水平。[蛄论]冷应 观指标之一。 关键词：宴时定量PCR；HsP70n诅NA；转录量；仔猪；冷应激。 1962年，Ritossa首先发现超常温环境可引起染色体发生蓬松现象并具有基因转录活性，称之为热休 克(heatshock，HS)现象。目前已经证实，很多应激源，包括高温、低温以及惊厥、毒物等都诱导细胞产生 热休克因子，热休克因子与HSP70 而稳定其结构，并通过复杂的分子问相互作用，利用水解ATP的能量，协助变性蛋白的复性，以维持蛋白 自稳态，提高细胞对应激的耐受性。这一现象广泛存在于原核生物和真核生物中，且有高度的保守性。 由于HSPT0在正常细胞中水平低，而在应激状态下可显著升高，因此成为热休克蛋白中研究的最深人的 表达水平比较低。HSP70mRNA在正常细胞内表达水平比较低，HSPT0合成也很少，但在应激状态其含量 有所变化。 冷应激是动物尤其是幼畜经常发生的应激，我们以冷刺激作为应激源，采用目前定量准确性最高的 mRNA 实时定量PCR法测定仔猪血液淋巴细胞中HSPT0mRNA的拷贝数，探讨应激前后不同时问HSP70 转录量变化规律，评价HSP／0mRNA作为应激程度评估标准的可能性。 1材料和方法 1．1试验动物及样品采集 用14头50日龄，体重为15kg±lkg的雄性“军牧一号”仔猪进行冷应激试验。正常饲养温度为18。C。 试验前和试验期间自由采食和饮水。在…4E IO。C进行冷刺激。采样时间点分别为应激0h、0．5h、 液，并迅速分离淋巴细胞，加人lmLTrizol后置于一84℃超低温冰箱冷冻保存。 _本试验由黑龙江自然基金(130317)和国家自然基金资助。 ht,ummm@yahoocom．orio m通if【作者，电话：04595029107，E—trail：jihonghljbynd@yahoo．cam．cn。 兽医部分囝419 1．2实验步骤 根据大鼠、牛和野猪的HSP70序列的保守区域设计引物。上游引物：gCCAAgCtggAcAAggc；下游引 CCAGATC． 标记荧光发光集团FAM，3’端标记荧光抑制基团TAMAR。 LB培养基中。37。C，200RPM，过夜。 从一84℃冰箱内取出已鉴定好的菌种，吸取IO／-L，加入到5mL Green质粒DNA制备盒提取质粒。根据分子量大小，将质量转化为拷贝数，梯度稀释后可作阳性定量模 板。将10”拷贝数浓度的重组质粒按1妒、l护、107、l旷、1旷、104，皿稀释，作为阳性质粒标准模板，用于荧光 定量PCR条件的优化，标准曲线的建立和样品的检测。 2 HSP70 mRNA转录量数据统计 应用SAS8．2软件对I娼F10n1心A拷贝数进行分析，结果如下(表1)： 表1淋巴细胞HSPT0mRNA转录量(又±SD) 时间 淋巴细胞HSPT0mRNA转录量(拷m数) 注：’代表P‘0．05(与应激0ll比较)。 3讨论 目前，对聊O 行定量，定量精确，重现性好。实时荧光定量PcR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现 了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软