实验 淋转花环.pptVIP

实验内容 淋巴细胞分离（第一次） E花环形成试验（总花环和活性花环，第二次） 淋巴细胞转化试验（形态法，第三次） 淋巴细胞增殖试验（MTT法，第三次） 细胞因子测定（ELISA法，第四次） 淋巴细胞分离实验原理 淋巴细胞成功分离后，便于在体外对机体免疫细胞进行鉴定、计数或功能测定；还可以用于E花环试验、淋巴细胞转化试验及淋巴细胞培养（需无菌操作）。 淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低。无论采用哪种方法，应最大可能保持细胞应有活性。 淋巴细胞分离实验原理 分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。 淋巴细胞分离实验原理 本实验采用的是密度梯度离心法。该方法是根据各类血细胞比重的差异（外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为（1.074±0.001），利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液（等渗的聚蔗糖-泛影葡胺，Ficoll）对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。 实验步骤 1.取5ml人肝素抗凝血于一大口径的无菌试管中，加3mlGKN液稀释，手动轻轻摇匀； 2.取备好的，内含2ml Ficoll液的无菌试管2管； 3.用无菌吸管吸取抗凝血4ml，分别沿管壁缓慢加入，注意保持两种液体界面清晰 ； 4.室温下立即置水平式离心机以2000rpm 离心20分钟，离心后分为4层。 5.用毛细吸管仔细吸取血浆与分层液界面处单个核细胞（PBMC）层（沿管壁周缘吸薄层云雾状）至一新的空离心管内。 6.加入5倍以上体积的GKN液洗涤3次，每次以2000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀主要为单个核细胞），调整细胞浓度为2×106/ml 。 E玫瑰花环形成试验原理 人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验(erythrocyte-roseette formation test)。 该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。 实验原理 总花环实验（Et花环）实验步骤 1.取0.1ml分离好的,细胞浓度为2×106/ml的淋巴细胞，加入0.1ml的1％SRBC悬液，混匀，37℃水浴15min， 500rpm离心5min，取出. 2.置于4℃冰箱过夜，小心吸去上清，沿管壁加1－2滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管，在手心小心混匀。 3.取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，镜下观察。 实验结果 E玫瑰花环试验 总E花环实验和活跃花环 淋巴细胞与SRBC在4℃ 环境作用2h 以上形成花环，代表外周血中T细胞总数占淋巴细胞的百分比，成为总E花环实验（Et）。 如果两种细胞悬液混合后，不经37℃和4℃ 作用立即反应仍有部分淋巴细胞形成花环，称为活跃花环（Ea），代表对SRBC亲和力高的一个T细胞亚群。 活性花环（Ea花环）实验步骤 1.取0.1ml分离好的,细胞浓度为2×106/ml的淋巴细胞，加入等量0.1％SRBC悬液，混匀，室温15min， 500rpm离心5min，取出. 2.小心吸去上清，沿管壁加1－2滴0.8%戊二醛，轻轻转动试管，在手心小心混匀，静置10-15min。 3.取出涂片，待自然干燥后，瑞氏染色，镜下观察。 实验结果 淋巴细胞增殖实验（ＭＴＴ法）原理 MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。 该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 ＭＴＴ法实验步骤 　将培养７２小时的淋巴细胞取出， 2000 r/min 10min，上清另置，用残液将沉淀细胞混匀配成悬液，取０.２ｍｌ细胞分别加２孔入９６孔细胞培养孔中，每孔０.１ｍｌ的细胞， 每孔加MTT（5mg/ml）100ul，4-6h，加二甲基亚砜（DMSO）100ul溶解细胞中的甲瓒，37℃ 10-15min，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值， 细胞因子的测定（ＥＬＩＳＡ） T细胞在受到非特异性有丝分裂原（PHA/CohA）刺激后，或者特异性抗原刺激被激活后，其形态和代谢产生一系列变