分子生物学基本研究方法01.pdf

第五章 分子生物学基本研究方法 张丽君 lj_zhang@pku.edu.cn 推荐参考书分子克隆 实验指南 • 基因操作: DNA分子的切割与连接、核酸分 子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列 分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩 增等。 • 基因工程: 在体外将核酸分子插入病毒、 质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新 组合，使之进入原先没有这类分子的寄主 细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 本章的主要内容 DNA操作技术 基因克隆技术 基因表达研究技术 基因芯片及数据分析 蛋白质组学等 5. 1 重组DNA技术涉及的一般知识介绍 三大成就： 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基 因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物 质基础问题； 二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留 复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； 三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操 纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息 的流动与表达机制。 • 由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子 的技术，无法对这类物质进行直接的生化 分析。 • DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序 列分析技术的进步直接推动了重组DNA技 术的产生与发展。 重组DNA技术主要包括以下几个要素： • 载体； • 工具酶； • 外源DNA, 即要克隆或表达的DNA片段； • 原核或真核(表达系统)宿主细胞。 载体应当具备如下条件： (1)能自主复制，使我们容易获得大量的载体或重组 的DNA分子. (2)具备可供选择的遗传标记, 便于进行重组体筛选 和鉴定。 (3)载体分子的合适位置上必须提供外源DNA插入的 位点，即克隆位点（限制性内切酶的切点）。便 于直接克隆不同种酶切割产生的DNA片段。 (4)载体本身应尽量小，不含或尽量少含多余的DNA 部分，这样可以容纳较大的外源DNA 。 (5)载体的特征应是充分掌握的，包括基因和酶切点 的准确位置，知道它的核苷酸顺序更好。 pcDNA3.1 • pcDNA3.1为方便克隆的 cDNA在哺乳动物细胞中高 效表达而设计的载体。它 由以下部分组成：f1噬菌体 的复制起始区用于大肠杆 菌内单链DNA的合成， pMB1(pUC)复制起始子用 于DNA在大肠杆菌内的复 制，SV40复制起始区用于 DNA在哺乳动物细胞内复 制，以及来自于SV40和牛 生长激素（BGH)的poly(A) 加入信号。多克隆位点 （MCS)两侧有T7噬菌体启 动子，使插入的外源DNA 的每一条链都能在体外进 行转录，表达CMV的早期 启动子立即启动。G418抗 性基因用来筛选已被 pcDNA3.1稳定转化的哺乳