分子生物学研究技术精选.docxVIP

Module 1:分子生物学研究技术cDNA文库cDNA文库，代表了生物体某一器官或组织mRNA中所有的或绝大部分的遗传信息。其构建过程总共有5个步骤（5项技术）：1、总RNA的提取；2、mRNA的纯化；3、cDNA的合成；4、cDNA文库构建；5、基因文库筛选。详细：1、总RNA的提取：目前常用的提取方法是异硫氰酸胍-苯酚提取法（Trizol提取法），提取步骤：（1）首先用液氮研磨材料成匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎并溶解细胞；（2）加入氯仿抽提，离心，收集含有RNA的水相；（3）用异丙醇沉淀，初步纯化RNA，获得样品用于下一步mRNA的纯化；（PS：实验中还常将含有RNA的细胞破碎物液通过硅胶膜纯化柱后，再通过低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱RNA，获得纯度较高的总RNA）；总RNA的浓度、纯度测定：通过分光光度计测其OD260和OD280值，OD260为1时相当于RNA总量为40μg/ml；而OD260/OD280的比值如果在1.8~2.0之间，则表示所提取的RNA纯度较好。2、mRNA的纯化：纯化原理，将真核细胞的mRNA分子具有5‘端帽子（m7G）和3’端poly（A）尾巴的特征结构，作为提取时的选择性标记。纯化提取方法：常用寡-纤维素柱层析法获，该方法利用mRNA3‘末端的poly（A）尾巴的特点，当RNA流经寡-纤维柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA或特异性结合