CRISPR操作-gRNA设计教程精选.pdf

CRISPR 操作-gRNA 设计教程 汉恒生物提供CRISPR 相关病毒包装服务 我们都知道一个基因（一个基因ID）往往可以编码多个转录本（多个NM 号）， 相应的也对应多个蛋白质（多个 NP 号）。一条mRNA 上编码蛋白质的区域称为 CDS （coding sequence）。一个基因产生的多个mRNA 往往有部分区域是重 叠的（图4a 红框内的区域），这部分重叠的区域叫做保守的CDS （consensus CDS），简称 CCDS。我们通过基因组编辑破坏一个基因，往往需要破坏所有的 mRNA 编码的蛋白，因此，我们选择编辑的位点通常位于CCDS 区域的上游位置 （靠近起始密码子ATG 的位置）。编辑的目的是在 CDS 区域随机引入碱基的缺 失或插入（indels），如此可以破坏三联密码子的阅读框，产生移码突变(图4b)。 图4 CCDS 和移码突变示意图。a，方框代表外显子组织情况，黑色方框代表CDS 区，红 色框内是该基因对应的CCDS；b，移码突变。一个T 碱基的插入改变了阅读框，最终导致 终止密码子的提前出现，蛋白质翻译提前终止。移码突变往往导致蛋白质功能丧失。 SgRNA 设计的站点介绍如下：  着重推荐Lei Stanley Qi Lab 的 /index.jsp （打不开请复制到浏览器地址栏） 这个在线站点功能比第一个丰富，可以选择基因编辑工具的其他用途 （激活，抑制基因表达等）（图5）。下一步就是选择物种（图6）。但只有常 见的9种。再下一步就是直接输入基因的名称（或序列）即可（图7）。 图5 选择编辑类型 图6 选择物种 图7 选择基因名称。 我们以人的 LDLR 基因作为例子说明，输入“LDLR“，然后点击 “CRISPR-ERA search”，会出来很多设计好的sgRNA （图8），ID 编号 #1-N（紫色框），后面一系列参数代表sgRNA对应的mRNA、基因组位置等。 绿色框里代表打分，简而言之是E+S 分越高越好。但这个不是很直观，我们 可以切换到图示模式，请点击红色框的链接查看排名前50位的sgRNA在基 因组上对应的位置（图9）。图示模式是兼容在UCSC 基因组浏览器中的，这 一工具包含的信息特别丰富，大家可以自己探索探索其他好玩的功能。 图8 LDLR设计的sgRNA 页面图。 如图9所示，出来的sgDNA集中分布在距离ATG 下游的第3和4个外 显子中，我们可以选择打分优先靠前的#1，2，3 号sgRNA。对于做基因的 敲除（KO）而言，强烈建议选择ATG 下游通常100 aa 以内范围内的sgDNA 来用（比如图 9 中的#2，4，9等）；而且，一定要位于CCDS 区域内（CCDS 是consensus CDS，即公共的CDS 区域，是针对很多个转录本[isoforms] 定义，图9 中绿色条框即是。这个很重要！！！如果默认不显示，需要在图示 的下面设置一下，如图10）。 图9 sgRNA在基因组上的相对各个外显子的位置。注意对应基因的方 向和CCDS 的位置。 图10 注意高亮信息的设置。  Feng Zhang lab：/。 这是最早的一个设 计站点。包括常见的16个物种。选中物种，把你要设计的区段序列扔到下 面的框里运行就行。但前提是你自己已经选好了位置（图11）。 图11  还有其他，如omictools 下面的Cas-Designer /cas-designer/。这个站点内容更加丰富， 比如物种覆盖式最多的，包括植物，昆虫等等（图12左）。这个站点也是输 入目的基因的序列定制的，不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。 图12  还有一些商业公司的，比如Thermo 下面的（图13）： /crispr/index.h