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HPLC使用指南精选
HPLC 使用指南
第一部分 使用前准备
1. 流动相
1.1 常用的溶剂体系
1.1.1 中性体系
甲醇-水
乙腈-水
异丙醇-水 (质谱常用,HPLC 使用较少)
1.1.2 酸性体系
0.08% (v/v) TFA in water - 0.08% (v/v) TFA in acetonitrile
0.1% (v/v) TFA in water - 0.1% (v/v) TFA in acetonitrile
*HPLC 常用的酸有:三氟乙酸,甲酸。
三氟乙酸:最常用。对体系 (基线)的稳定性好。但配置好的流动相溶液不稳定,不能长时间放
置。沸点低,容易除去。酸性较强。
甲酸:常用。沸点较低,较易除去。但对体系 (基线)的稳定性较差。
**酸性体系会减少色谱柱的使用寿命。因此在使用不同的色谱柱之前,需要注意填料可耐受的酸
碱度。一般C18 的填料的耐受范围是pH3-8 。
1.1.3 缓冲体系
0.05M TEAB - acetonitrile
0.1M TEAB - acetonitrile
*HPLC 常用的缓冲溶液体系有:三乙胺-碳酸缓冲液 (TEAB),三乙胺-醋酸缓冲液 (TEAA),三乙胺-
磷酸缓冲液 (TEAP)
三乙胺-碳酸缓冲液 (TEAB):沸点较低,容易除去。常用。
三乙胺-醋酸缓冲液 (TEAA):沸点较高,不易除去。多用TEAB 替代。
三乙胺-磷酸缓冲液 (TEAP):根据需要使用。
**摩尔浓度指TEA 的摩尔浓度,酸用来调节pH 值。根据需要调节所需要的pH 值。例如:pH7.5
的TEAB (0.05M) 水溶液。
1.2 溶剂过滤及过滤设备
1.2.1 溶剂过滤
必须过滤的流动相:经过配置的酸性体系及缓冲体系
可以不过滤的流动相:中性体系,即纯水,纯乙腈,纯甲醇
*所有接触过非色谱纯的容器的溶液,都需要过滤。过滤之后需要用标签注明过滤的日期。
** 已过滤的溶液,经过长时间放置,需要重新过滤。
1.2.2 溶剂过滤器
* 由过滤杯,过滤头,接收瓶及铝合金夹子组成。铝合金夹子可以固定过滤杯及过滤头,不能固定
接收瓶,因此在拿放溶剂过滤器的时候要握紧接收瓶。
**使用过滤器后,需注明过滤头中的滤膜是水相还是有机相。
1.2.3 滤膜
50mm, 0.45um 水相滤膜过滤水用
50mm, 0.45um 有机相滤膜过滤有机溶剂用
*两者不可混用,当过滤一种溶剂之后,必须将过滤头内的溶剂抽干,再换不同种类的滤膜,否则
会导致滤膜溶解进入过滤头。如果发生滤膜溶解的情况,比如过滤水相之后没有将过滤头内的水
抽干就直接放入有机相滤膜,此时滤膜非常容易被溶解,需要用水大量冲洗过滤头及接收瓶。反
之亦然。
1.2.4 排气
无论流动相时候过滤过,在使用之前均需要超声排气。排气时间以不超过10min 为宜,且温度较
低为宜。因为超声时间过长会使温度升高,气体会重新溶解进入流动相。
2. 仪器
开机顺序:泵 → 紫外检测器 → 电脑 → 工作站 → 软件
2.1 泵
2.1.1 控制模式
内控:由控制面板控制。外控指示灯灭。只能设置恒定梯度。
外控:由电脑通过工作站控制。外控指示灯亮或闪烁 (闪烁为暂停状态)。可以设置线性梯度。
*通过menu 2 转换控制模式
2.1.2 冲洗
冲洗前需先开启空气阀。
冲洗可以快速替换体系内的溶剂,排除体系内的空气。
关闭冲洗后关闭空气阀。
*当沉子内没有液体时,冲洗时可能不易吸上液体。此时可以打开空气阀,用针管从空气阀抽出空
气,可以快速吸出液体。
2.2 管路系统
泵之后的管路的冲洗:
可以将色谱柱的位置接上两通,加大流速 (每一个泵的流速可以设置到3ml/min )冲洗。主要冲
洗六通阀 (此时应在inject 状态)及检测池内的管路。
2.3 紫外检测器
2.3.1 分类
分析型与半制备型紫外检测器不可混用。
在使用半制备紫外检测器时,流出口需要有反压装置。
冲洗管路之后,可以将紫外检测器拆下,对光查看石英孔里是否还有气泡。
2.3.2 预热
紫外检测器需要预热,即至少开机15min 之后才可进样。此时一般为平衡柱子的时间,所以一般
不需特意预热紫外灯。
2.3.3 设置
常用的波长有214nm,220nm,254
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