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蛋白质分析的意义 基础科学研究 这主要是生命科学研究向分析学家提出的课题。在生命科学研究中，人们需要了解各种蛋白质的组成、结构与功能的关系，蛋白质的存在形态以及与小分子，甚至金属离子的相互作用等等。 食品的鉴定与评价 蛋白质是生物体的重要营养物质，也是食品的重要营养指标。测定食品店品中蛋白质的含量对指导食品的加工工艺的改革、优化保健食品的配方以及合理配膳均有重要意义。 评价健康、诊断疾病 人体内的酸碱平衡，电解质平衡，遗传信息的传递，物质的代谢和运转都与蛋白质有关。 蛋白质的分析方法 一类是利用蛋白质的共性，如含氮，含肽键和折射率等性质测量蛋白质的含量； 二是利用蛋白质中某些特定的氨基酸残基、芳香基团、酸性和碱性基团等测量蛋白质的含量。 我们熟悉的克氏定氮法是第一类分析方法中的一种，而本文要介绍的等电聚焦法属第二类分析方法。克氏定氮法分析蛋白质只可通过测定待测物的总含氮量进而推出蛋白质含量，不能分析出所含蛋白质种类及各类含量而电泳法正好弥补了这个不足。 回顾一下等电点的有关知识 设HA为一两性物质，处于等电点时 x(H2A+)=x(A-),即 所以，pH=1/2(pKa1+pKa2)=pI(等电点) 氨基酸的等电点计算可以参照上述公式。 蛋白质是由a氨基酸组成，氨基酸通过肽链连接起来成为多肽，长的多肽就被称为蛋白质。氨基酸的种类和序列决定蛋白质的性质，蛋白质末端有-NH3+， -COO- ，侧链有-NH3+，-COO-，-S-等酸、碱性基团，可见蛋白质为两性物质，有等电点。 电泳的原理 溶液中任何物质由于其中本身的解离或表面吸附其他带 电质点而带电，带电颗粒在电场中移动，移动方向取决于它 们的带电符号。电泳技术就是由各种带电粒子在电场中迁移 率不同而进行分离的一种技术。生物大分子如蛋白质、核 酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，带电的蛋白质分子在电 场中会朝着与自己所带电荷相反方向移动，根据各种蛋白质 分子的移动速度不同，对各种蛋白质进行分离。 在电场中，速度通常用泳动度来表示。泳动度是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。即： U=v/E=(d/t)/(V/L)=(d/V)*(L/t) 式中u---------泳动度，cm2/(V.s) V---------泳动速度，cm/s E--------电场强度,V/cm d-------颗粒泳动距离，cm L------支持物有效长度，cm V------实际电压，V t-----通电时间，s 通过测量d,L,V,t,即可计算出颗粒的泳动度，而当外界因素一定，泳动度是一物质的特性，通过测泳动度，可以鉴别待测物。 蛋白质等电聚焦电泳的基本原理 1．分离成为可能： 由于各种蛋白质的氨基酸组成不同，因而有不同的等电点。当pHpI时，蛋白质带正电荷，在电场的作用下向阳花负极移动；当pH=pI时，蛋白质所带净电荷为0，在电场的作用下不发生移动，当pHpI时，蛋白带负电荷，在电场的作用下向正极移动；不同蛋白质的搭配组成差别很大，因此蛋白质的等电点范围很宽。 等电聚焦电泳技术就是在电泳支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用而泳动。当蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带。这种效应称之为“聚焦效应”，保证了蛋白质分离的高分辨率 ，是等电聚焦最为突出的优点。 2．等电聚焦中pH梯度的形成： pH梯度的形成依靠有缓冲作用的两性载体电解质，载体电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在2.5到10之间，载体两性电解质溶液的pH大约是该溶液pH范围的平均值。在没有电流时，所有载体两性分子都带电荷，所带总的净电荷为0。 第二步： 根据两性电解质的性质，在泳动过程中不断地与溶液交换质子，当达到平衡时，即两性电解质得失质子相等，不再出现质子交换，载体两性电解质至达等电点并停留在自己的pI