烟草根结线虫卵寄生真菌的筛选..docxVIP

烟草根结线虫卵寄生真菌的筛选. 　　摘要本研究对采自云南省各地州烟草根结线虫发生地域的土壤、病根样品进行根结线虫卵寄生真菌的筛选、测定，从中筛选到了5株对南方根结线虫卵寄生效果显著的菌株，其寄生率达69.5-95.5%。田间小区试验表明，生防菌剂在烤烟团棵期前对南方根结线虫数量防效可达35.49-84.29%，其中生防菌FDT-10、HLD-5-8的防治效果与化学药剂相当。关键词烟草根结线虫卵寄生真菌南方根结线虫寄生率根结线虫是危害农作物的重要病原之一，其在全世界广泛分布，寄主范围广泛，植物受害严重，世界上重要的经济作物每年由根结线虫病造成的损失高达数百亿美元[1]。同时它能使真菌和细菌易于侵染植物，是诱发植物病害的重要原因之一[2]。对于根结线虫的防治，自40年代发现化学杀线剂后，其在线虫防治中大显身手。但化学杀线剂的高成本、高毒性及高残留，对环境污染严重，使用过程中???人、畜也不安全，因此许多化学杀线剂已被禁用；轮作和抗性品种等的应用对根结线虫的防治有一定的作用，但有其局限性。因此人们在开发一些高效、低毒、低残留、高选择性的杀线剂的同时，生物防治线虫病害日益受到重视。根结线虫在土壤中受许多生物影响，尤其是线虫寄生真菌被认为是自然条件下控制线虫的主要因子之一。近年来，我国学者对根结线虫的致病性、分布、病原特征、发生规律和防治等做了大量的研究1。国外学者曾有报道粉红粘帚霉菌和哈次木霉及绿色木霉对线虫具有生防活性[3-5]，且世界上许多国家利用淡紫拟青霉防治根结线虫孢囊等多种线虫获得成功[6]。目前已报道的根结线虫寄生真菌30多种，研究最多的是Paecilomyceslilacinus和Verticilliumchlamydosporium。寄生真菌对根结线虫的寄生率或致病力测定是生物防治的基础工作。但目前国内仅少数人对根结线虫的寄生率或致病力作过测定[7,8]。GodoyGR等研究14种真菌对胞囊线虫和花生根结线虫的寄生性。本课题组从1998年开始，从云南省各地植烟区采集分离了大量的根结线虫生防菌株，进行了烟草根结线虫生物防治途径的探索研究。本文主要报道室内根结线虫卵寄生真菌的筛选结果及部分菌株的田间小区试验结果。1材料与方法1.1分离出根结线虫二龄幼虫，挑取活动缓慢或死亡幼虫经灭菌水漂洗后，于PDA培养基上培养，培养一周后观察生长的菌落，分离进行纯培养。1.2从病根样品中挑取根结线虫雌虫，选取褐色雌虫用0.1%NaClO进行表面消毒，灭菌水反复冲洗，于2%水琼脂平板上25℃培养，培养一周后观察生长的菌落，分离进行纯培养。1.3将从样品中分离到的线虫卵分散在2%水琼脂平板上，24-48小时后观察，将有真菌定殖现象的卵转移到PDA营养培养基上，25℃暗培养，待真菌长出，鉴定保存。1.4平板分离：分离采用drechsler法。1.5菌株有效性测定：1.5.1将菌株于PDA平板上涂布培养6天，待菌株充分生长产孢后用灭菌水冲洗制备成相同数量级的孢子液备用。1.5.2于温室盆栽番茄根系挑取发育基本一致的根结线虫卵块，于100筛目的筛子上用流水缓缓冲洗，后置于500ml三角瓶内加1.5%NaClO200ml剧烈震荡3-4min，将卵块充分震荡分离，自来水充分冲洗，用200、500目筛进行收集，于500目筛上即可收集到纯净的卵，无菌水多次冲洗，稀释计数备用。1.5.3充分摇匀孢子液和线虫卵液，吸取2ml孢子液和0.5ml线虫卵液于一灭菌试管中，以2ml灭菌水加0.5ml线虫卵液为空白对照，每处理六次重复，于6天后观察线虫卵孵化情况以及用Axiovert135倒置显微镜镜检各处理菌株对线虫卵的寄生情况。1.5.4将各处理被寄生的线虫卵挑出，用灭菌水在500筛目筛网上充分冲洗收集，接种于PDA培养基上进行再分离，比较再分离获得的菌株与接种菌株是否为同一菌株。1.6优良菌株的田间小区试验：1.6.1试验安排：试验地选择根结线虫常年发生较重的植烟地块。处理为A、B、C、D、E、克百威、空白对照。田间随机区组设计，每处理烟株为30株，三次重复。于烟苗移栽前将药剂塘施。1.6.2试验地土壤根结线虫数量变化调查：烟苗移栽时、烟株团棵期、采收结束分别取土样，漏斗分离法分离调查根结线虫数量变化。2结果与分析2.1室内筛选结果分析通过采用多种实验方法，本研究从云南主要烟区采集的458份样品中初步分离得到菌株432株，主要分属Paecilomyces拟青霉属、Penicillium青霉属、Fusarium镰孢菌属、Mucor毛霉菌属、Phoma柱孢、Verticillium轮枝菌属、Trichoderma木霉菌属、Greenmuscardine绿僵菌属。分离鉴定的各种属真菌比例 表1室内筛选效果相对较好的菌株 　　通过室内生物测定结果分析表明，所筛选材料中73