细胞培养常用技术78.pptVIP

细胞培养常用技术;Cell;第一节 细胞形态结构观察技术;倒置显微镜;生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。 若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。;BMSCs;;(二) 暗视野显微镜;利用这种显微镜能见到小至5nm的质点，分辨率比普通显微镜高了40倍，有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。;(三)相差显微镜;显微镜观察;;(四)微分干涉差显微镜;DIC显微镜首先DIC利用的是偏振光。此外，除了物镜外，还增加了四个光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。;DIC显微镜;荧光显微镜的成象原理;分裂细胞的 免疫荧光图像;用荧光素标记抗体所显示出的细胞中蛋白质的分布状态;(六)激光共聚焦显微镜;二. 主要电镜制作技术;光学显微镜 → 0.2μm 电子显微镜 → 0.2 n m ;电子显微镜与光镜的主要区别; 0.61λ D= —————— N·Sin α/2 ;各种光及电子束的波长;透射式电子显微镜(TEM);;由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05?m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机 制作。电子显微镜的放大倍 数最高可达近百万倍。;以锇酸和戊二醛 固定样品，以环 氧树脂包埋，以 热膨胀或螺旋推 进的方式推进样 品切片，切片厚 度20~50nm，切片 采用重金属盐染 色，以增大黑白 反差。 ;用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。;亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。; 细胞冰冻断裂后的电镜图像;电子枪发射出的电子束作为“探针”，当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化，即可显示出原子水平的凹凸形形态。;扫描式电子显微镜;耳听毛的扫描电镜图像;;其关键部件是有一个加上一定电压的精密探针，当探针接近物质时，由于‘隧道效应’而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。;分辨率： X-Y向0.1nm（原子级分辨率）;细胞常用的观察及染色方法; 活细胞的观察检测方法;暗视野显微镜技术观察活细胞 （dark field microscope) 原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。 优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。 应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。 缩时显微摄影术观察 （time-lapse cinemicrophotagraphy，TLCM） 优点：可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。 缺点：较昂贵;体外活细胞染色观察;中性红染色 常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。 结晶紫染色 使用浓度为0.1％，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。 台盼蓝染色 用0.5％浓度的台盼蓝（trypan blue)，用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。 ;;二、培养细胞常用的染色方法;1、细胞固定的基本方法;固定前的准备： 各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。 悬浮细胞： 离心（800～1000r/min）→PBS/Hanks漂洗2～3次 贴壁细胞： 用镊子轻轻取出盖片→PBS/Hanks漂洗2～3次 注：漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。 ;常用固定液;2、细胞常用的染色方法;;Giemsa（吉姆萨）染色法;;;3、细胞特殊的染色方法;Feulgen（福尔根）染色法;;考马斯亮蓝（Coomassie，BB）染色法;;过碘酸席夫反应法（periodic