用双水相萃取分离纯化磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶.pdf

( ) 生物工程学报12 增刊 :168～171 ,1996 Chinese Journal of Biotechnology 　　　　　 用双水相萃取分离纯化磷酸甘油酸激酶 和磷酸甘油醛脱氢酶 谭天伟 　沈忠耀 (清华大学化学工程系　北京　100084) ( ) ( ) 摘 　要 　用聚乙二醇 PEG / 羟丙基淀粉 Reppal PES 双水相体系两步法从黄豆中分离磷酸甘 ( ) ( ) 油酸激酶 PGK 和磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 。PGK 在上相收率及 GAPDH 在下相收率均在 ( ) ( ) 80 %以上。放大采用离心倾析机 decanter 连续处理匀浆液 ,用离心萃取器 separator 完成双水 相体系的萃取两相分离。整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的优点。 关键词 　双水相萃取 ,磷酸甘油酸激酶 ,磷酸甘油醛脱氢酶 ,分离纯化 ( ) ( ) 　　目前常用的双水相体系有高聚物 PEG / 高聚物 dextran 体系和 PEG/ 盐体系 , PEG/ 盐体系已成功地应用于酶大规模纯化[1 ] 。高聚物/ 高聚物体系比 PEG/ 盐体系具有 更广泛的应用前景 ,但主要问题是 PEG/ dextran 体系成本太高。谭天伟等人系统地研究 了十几种水溶性高聚物的相图[2 ] ,结果表明 ,PEG/ Reppal PES 体系成本较低 ,只有 PEG/ dextran 体系成本的 1/ 8 , 因而有可能取代 PEG/ dextran 体系。本文报道研究用 PEG/ ( ) Reppal PES 体系从黄豆中分离纯化磷酸甘油酸激酶 PGK , 磷酸甘油醛脱氢酶 ( GAPDH) 的结果。 1 　材料和方法 11 　材料 PEG4000 为德国 Serva 公司产品 , Reppal PES200 从瑞典 Reppe Glykos AB 公司购 ( ) 得。PGK 和 GAPDH 标准酶 兔子肌肉 为 Serva 公司产品。黄豆从德国当地超级市场购 买 ,其他化学试剂均为分析纯。 12 　酶活性与蛋白含量测定 蛋白含量测定采用 Bradford 法(3) , 以牛血清蛋白为标准蛋白。PGK 活性采用 (4) ( ) Bergmeyer 法测定 ,分析液 ;01mol/ L 三乙醇胺HCl 缓冲液 p H7 6 ,5mmol/ LMgSO4 , 05mmol/ L ED TA , 1. 1mmol/ L A TP , 6mmol/ L 磷酸甘油酸 PGA ,0 2mmol/ L NADH , 4u/ ml GAPDH 。GAPDH 活性分析液组成除 PGA 浓度为 3mmol/ L 和 GAPDH 用 7u/ ml PGK 替代外 ,其他成份和 PGK 分析液相同。 13 　黄豆匀浆液制备 联系地址 :北京化工大学化工学院生物化工研究室。 本文于 1995 年 3 月 22 日收到。 © 1