用非去污剂法从鼠肺中分离细胞质膜微囊.pdf

维普资讯 第44卷 第 3期 斟 拳 IL 童 用非去污剂法从鼠肺中分离细胞质膜微囊 D一D] 姜艳潘最陈建文黄芬 ] (中国科学院生物物理所生物大分子国家重点实验室．北京100101) nb(q卜厶一)．q‘J- 摘要 细胞质膜微囊(Caveoa／e)是质膜上直径 50～100nn1的烧瓶状的内陷微区，行使多种生 物学功能，并且与细胞信号转导及疾病有关 用非去污剂法首次从组织中分离出Caveolae，电 子显微镜下观察为单独或成 串出现 的脂双层结构的小囊泡．电泳结果显示这种方法与Tri． tonX一100法相比，能够更多地保 留Caveolae上的蛋 白成分 免疫印迹实验验证，在Caveolae上 存在特异蛋 白Caveolin以及重要的参与信号传递 的激酶PKGa． 关键词细胞质虞散囊 岛， 细胞质膜微囊(Caveolae)是直径为 50～100nEff的烧瓶状质膜 内陷微区．这种结构广泛 存在于各种类型的细胞中，在 内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞 中尤为 丰富_lJ．到 目前为止，Caveolae的确切生理功能尚不十分清楚 ，但各方面的实验结果表 明，它 参与多种生物学过程 ：不依赖包涵素的液饮 (potocytosis)、胞吞转运 (transcytosis)、胆 固醇转 运、信号转导以及细菌、病毒的内化等 2【，33 虽然早在 40多年前 YamadatJ已发现了这类囊 泡 ，但直至 90年代才得到人们的重视 ．这是一个崭新的研究领域 ，国际上投 以极大的兴趣并 期待着从中挖掘 出丰富的宝藏． 目前 ，Caveolae的分离提纯主要根据它在低 温下不溶于非离子去污荆 TritonX-100的性 质…1 利用这种方法，人们 已发现 Caveo／ae的脂成分主要是鞘磷脂、胆 固醇和糖基鞘磷脂等， 此外其 中还富含Caveolin、GPI．锚蛋 白、G蛋 白的a亚基、蛋 白激酶 c的a亚型等一系列与信号 转导密切相关的蛋 白 ．但是，这一方法也存在一些缺点，如分离提纯过程 中去污剂有可能 将部分本位于 Caveoa／e上易溶 于TritonX一100的脂成分或蛋 白质除去 ，或者去荇剂会使更多 的GPI锚蛋 白、糖基鞘磷脂或酰化蛋 白的疏水酰链在抽提过程 中与胆固醇聚集被一起分离下 来 ，为了克服这些不利因素，Anderson等人发展 了一种新的非去污剂法_5J．他们利用这种膜 结构具有密度低 ，在密度梯度离心中可漂浮的特性 ，从培养的人成纤维细胞 中获得了高纯度的 Caveoa／e．本工作首次应用这种非去污剂法从组织中直接分离 出Caveolae，并对其形态及蛋 白 成分做初步研究 ． 1 材料与方法 (i)材料． 实验用 昆明鼠4只，体重 18～22g．Permll和Optiprep分别购 自Pharmacia 和GIBCO．Tricine为 Sigma产品．硝酸纤维素纸购 自Whatman 抗 PKG-alaG(1：1000)单 克隆抗体 ，Rockf0rd(美 国)产品；抗 CaveolinlaG(1：1000)单克隆抗体 ，王平原博士 (美 国 Texas大学西南医学中心)惠赠 ；HRP一羊抗 鼠 IgG(1：1000)，北京挚诚生物工程研究所 ．其他 试剂均为 国产分析纯 ． ()Caveolae的分离提纯． 所有操作均在 4℃进行．取小 鼠肺 (湿重约 750nag)，用剪刀 剪碎 ，置于 5lnL冰冷的缓冲液A 中(0．25otol／L蔗糖，1mmol几 EDTA，20mmol几 Triclne， pH=7．8)．用组织匀浆器充分匀浆后装人 10TnL离心管中，1500 g离心 10min．上清液 维普资