第10章 蛋白质的分离与测定技术.pptVIP

(二)、蛋白质分离提取的一般步骤 (1)材料的选择和预处理； (2)破碎生物组织(原料是细胞外分泌物时无需此步)，并用适当的缓冲液将蛋白质提取出来； ⑶用离心法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片与溶液分开； (4)应用盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来； (5)进一步应用层析法或电泳法使各种蛋白质分开； (6) 结晶或制成冻干粉。 蛋白质分离纯化方法： 溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法 分配系数不同：如分配层析法 吸附性不同：如吸附层析法 在电场中运动速度不同：如电泳法 沉降系数或密度不同：如离心法 分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法 生物学特性不同：如亲和层析法 以上提取纯化方法的适当结合，在多数情况下，足以获得纯化的蛋白质。 （三）提取后的进一步纯化 1、选择性变性沉淀除去杂质； 2、分段盐析及有机溶剂沉淀 3、吸附色谱法 4、多糖基离子交换色谱法； 5、凝胶过滤分离； 6、亲和色谱法 7、制备超离心分离； 8、其它分离纯化方法以及 后期结晶 三、蛋白质的浓缩和脱盐 （一）、蛋白质的浓缩 1、沉淀法：中性盐或有机溶剂。 2、吸附法：如干葡聚糖凝胶G－25（或吸水棒）。 3、超滤法： 4、减压蒸馏法： 5、冷冻干燥法： 6、离子交换层析法 7、有机聚合物干燥法 聚乙二醇等聚合物进行干燥。 （二）、蛋白质的脱盐 常用的脱盐方法： 透析法 超滤法 分子筛层析法 第三节 蛋白质的含量测定 一、双缩脲法 1、常量双缩脲法： 早期阶段的测定非常有用。 双缩脲法的原理是铜离子与蛋白质的肽键结合，形成紫红色络合物，此物质在540nm处有最大吸收，可以比色测定， 此法常用于0.5mg/mL-10mg/ml蛋白质溶液的测定。 二、Folin—酚试剂法(Lowry法) 原理:在碱性条件下，蛋白质与碱性铜溶液中的铜络合使得肽键伸展， 暴露出的酪氨酸和色氨酸与磷钼钨酸反应，产生深蓝色,500nm处比色。 三、紫外吸收法测定蛋白质含量 是利用物质在紫外光区（200～400nm）特有的吸收光谱 1.280nm紫外吸收法 利用蛋白质在280nm有吸收峰进行测定 需同样条件爱下制作标准曲线。 准确性较差。 2．280nm和260nm处的吸收差法 由于有核酸的干扰，可利用280nm和260nm处的吸收差求： 蛋白质的浓度（g/L或mg/ml）=(1.45A280nm- 0.74A260nm）×稀释倍数 3．215nm和225nm的吸收差法 肽键在230nm以下有强吸收，波长越短，光吸收越强.用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白成分引起的误差。 蛋白质的质量浓度（g/L或mg/ml）=0.144(A215nm- 0.74A225nm） 四、考马斯亮蓝染色法（Brodford法） 蛋白质通过范德华键与染料考马斯亮蓝G—250结合，引起染料最大吸收峰的改变（颜色由棕红色变为蓝色），从465nm变为595nm处的光吸收值增加，即可进行定量。 五、凯氏定氮法 被测样品与浓硫酸共热时分解产生氨，氨和硫酸结合生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下分解产生氨。用水蒸气蒸馏法将氨收集于过量的硼酸中，然后用标准酸溶液滴定。根据所测得的含氮量，利用蛋白质中氮的含量约为6.25％，计算样品的蛋白质含量。 第四节 蛋白质的纯度标准 一、电泳法 如果样品在凝胶电脉上显示一条区带，说明样品在其荷质比方面是均一的。 不同pH下电泳，出现一条区带，说明样品的分子量是均一的，因此只适用于含有相同亚基的蛋白质。 等电聚焦电泳 如果只出现一条区带，那么足以证明此蛋白质为均一蛋白质 脲的凝胶电泳用于鉴定在低离子强度下难溶的蛋白质纯度。 双向电泳 第一向：等电聚焦电泳 第二向：SDS水平方向反映出蛋白在pI上的差异; 垂直方向反映出它们在分子量上的差别 二、通过层析性质的检测 各分级组分的比活力应当恒定，则得到的组分是均一的。 三、免疫化学法 免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射免疫、酶标免疫分析、发光免疫分析和Western blotting等。 四、蛋白质化学结构分析法 纯蛋白质：N—末端氨基酸 总的氨基酸分析 五、超速离心沉降分析法 脂蛋白和膜束缚的蛋白质最好用超速离心法。 在离心管中若出现明显的分界线，或者分部取出离心管中的样品，管号对样品浓度作图，若组分的分布是对称的，则表明样品是均一的。 六、其它方法 纯蛋白质的OD280/OD260的值应为1.75。 污染蛋白质生物活力的消失也是一个间接的纯度评价标准。 利用蛋白质的特殊功能特性(如激素、酶、氧载体等)检验纯度。 (6) 离心法：超速离心法 蛋白質分子在 离心時，其 分子量、分子密度、組成、形狀 等，均会影响其沉降速度。 沉降系數 ：单位离心力场下的沉降速度