工程菌的高效表达和稳定性精选.ppt

提高质粒稳定性的方法 1.选择合适宿主菌 宿主菌的比生长速率、基因重组系统的特性、染色体上是否有与质粒和外源基因同源序列等都会影响质粒的稳定性。 2.选择合适的载体 改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及不同的目的采取不同的策略。 3.选择压力 从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。 4.分段控制培养 提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。 可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。 5.控制培养条件 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键 步骤。 环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤其重要。 1）培养基的组成 培养基对克隆菌稳定性的影响 培养基 克隆菌 F20-25 不稳定型 PBB W3110trpAE1trpR tnaA 7% 结构性 MM (RSF 2124-trp) 99% 结构性 PBB W3110 trpAE1 trpRam27 12% 分配性 MM (pSC101-trp) 48% 分配性 2）培养温度 对于温度敏感性质粒，为了控制在生长前期其外源基因不表达，一般采用二阶段温度培养系统，即在菌种生长阶段，采用较低的培养温度，当菌体生长至适宜浓度和生长时期时，提高温度进行诱导，使外源基因表达。重组工程菌的生长和产物合成时的PH往往不同。 3）菌体比生长速率 比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。 例如: 在酵母系统中，?大则质粒pJDB248稳定性高。 如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。但很难达到。在某些情况下，可以利用分解代谢物效应控制菌的比生长速率，降低α值，提高重组质粒的稳定性。 比生长速率 比生长速率μ为表征微生物生长速率的一个参数,其大小为0.693除以倍增时间td（菌体量倍增）。 推算过程：假定在任何时间（t），微生物细胞数目的增长速率（dN/dt）正比于已经存在的总细胞数目（N），则得：dN/dt=μN。 　　经积分得：lnNt-lnN0=μt，对于一倍增时间，t=td , Nt=2N0的培养物：ln2N0-lnN0=μtd 。易得：μ=ln2/td 。 　　 参数含义： μ——比生长速率，单位h-1 　　 t——时间，单位h 　　 N——任何时间处微生物细胞量 　　 Nt——开始培养t时间过后生物细胞量 　　 N0——开始时微生物细胞量 　 　 td——倍增时间，即为微生物细胞量变为原来的两倍所需的时间 6.固定化 固定化技术包括固定化酶技术与固定化微生物技术。固定化微生物技术是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域,以提高微生物细胞的浓度,使其保持较高的生物活性并反复利用的方法。 良好固定化细胞方法的条件： 1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度； 2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰性的，固定过程温和，对细胞损伤轻； 3）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的pH值和温度下，不会被破坏； 4）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的机械稳定性和化学稳定性； 5）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应； 6）单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞。 固定化细胞的制备方法 常用的有吸附法、包埋法、