宮澤 淳夫 細胞内標識による生物分子トモグラフィー 1 研究実施の概要.pdf

平成20 年度 「生命現象の解明と応用に資する新しい計測・分析基盤技術」 実績報告 平成 18 年度採択研究代表者 宮澤 淳夫 (独)理化学研究所放射光科学総合研究センター・グループディレクター 細胞内標識による生物分子トモグラフィー 1. 研究実施の概要 生物試料の電子線トモグラフィー観察に向けて、電子顕微鏡で検出可能な細胞内分子標 識法の開発を行っている。これまで、金属結合タンパク質であるメタロチオネイン(MT） ３分子を、タンデムにつないだ標識タグ（3MT）が遺伝的にコード化できる標識として有 用であることを示してきた。今年度は、ポストシナプスに集積するPSD-95 を3MT で標 識し、細胞内に形成される「3MT＋金属クラスター」の電子線トモグラフィーによる三次 元再構築を行った。その結果、3MT 標識タンパク質の細胞内での立体構造や三次元配置を 解析するのに電子線トモグラフィーが有用であることを示した。また、3MT 標識はこれま で多量体を形成するオリゴマータンパク質や細胞内局所で集積するクラスタータンパク質 に応用してきたが、今年度は繊維状タンパク質であるF-アクチンの3MT 標識の検討を開 始した。さらに、MT 以外の金属結合モチーフとして、カドミウムと結合する性質をもつ フィトケラチンアナログを利用することで、3MT よりも高いタグ1kDa あたりのカドミウ ム含有量が得られることが示された。 また、クライオ電子線トモグラフィーの実施に向けて、大腸菌だけでなくヒト血小板を用い て、手動操作による氷包埋試料のクライオ電子線トモグラフィー観測、およびデータを収集し、クラ イオ電子線トモグラフィーにおける解析の重要な問題点を明らかにした。そして、最新の試料作製 技術である CEMOVIS （Cryo Electron Microscopy Of Vitreous Ice）の改善に成功し、これ により、技術のみが先行しその信頼度等が評価されてきていなかったこれらのクライオ方法につい て、我々のグループで検証できる体制が整った。 さらに、電子顕微鏡のシステム開発においては、国産の電子顕微鏡に対し、クライオ電子線ト モグラフィーに必要なモジュールとして、傾斜シリーズ撮影モジュールを開発中である。３次元再 構成に関しては、 １軸、および２軸傾斜共に分子レベルの電子線トモグラフィーが可能なパッケー ジを更に改善し、傾斜角度の精密化やデフォーカスによる像変形の改善が行えるようになった。 2. 研究実施内容 ＜分子ラベル開発グループ＞ 昨年度、ポストシナプスに集積する性質をもつ PSD-95 が、3MT 標識によって、ポストシナプス 内の電子密度の高い領域として観察されることを報告した。今年度は、この細胞内に観察された 電子密度の高い領域の電子線トモグラフィーによる解析を行った。試料切片を電子顕微鏡に取り 付けたトモグラフィーシステムによって±60 度傾斜させ、1 度ずつの傾斜像を撮影した。その後、三 次元再構築ソフトウェアを用いて、得られた傾斜シリーズから三次元再構築を行った。その結果、 電子密度の高い領域は切片内で楕円体状に集積していることがわかった。金コロイド抗体を用い た免疫電子顕微鏡法では、目的タンパク質の存在位置の情報しか得られないのに対し、3MT で 標識されたタンパク質に電子線トモグラフィーを応用すれば、目的タンパク質の細胞内配置と共 に、目的タンパク質が細胞内で形成するクラスターの立体構造の解析も可能になることが確かめ られた。 電子顕微鏡観察のための 3MT を用いた細胞内分子標識法の種々生体内タンパク質への応 用の一つとして、興奮性神経細胞のスパインに高濃度に存在する線維状タンパク質である F-アク チンの検討を開始した。神経興奮やシナプスの発達によってスパインの形態が大きく変化すること から、スパイン内 F-アクチンの動態も変化していることが予想され、細胞機能と関連した分子の構 造変化を電子顕微鏡で可視化するための検討例として適していると考えている。まず始めに、細 胞において F-アクチンへの線維化を阻害しない 3MT 標識-アクチンのコンストラ