利用MTT法测定不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖作用的抑制效果.doc

利用MTT法测定不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖作用的抑制效果 摘要：采用MTT法测定不同浓度的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil ，5-Fu）对宫颈癌Hela细胞增殖作用的抑制效果，发现5-氟尿嘧啶对Hela细胞的增殖抑制基本上呈量效依赖关系。不同浓度的5-氟尿嘧啶对宫颈癌Hela细胞的生长均有一定的抑制作用。5-氟尿嘧啶的化疗剂量在50 ~ 150 ug/ml之间时，既可以得到较高化疗的效果, 又可以尽量减少副作用。 关键词：MTT法、5-氟尿嘧啶、Hela细胞、抑制 前言： 近年来，宫颈癌的化学治疗越来越受到国内外的重视，5-氟尿嘧啶作为DNA抑制抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，抑制的生物合成 Hela细胞株、5-氟尿嘧啶、胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO) 、96 孔细胞培养板、新生牛血清、CO2 细胞培养箱、酶联免疫检测仪、多用途振荡器。 胰蛋白酶消化液用Hanks液配制成浓度为0. 25%溶液；MTT用PBS液配制成浓度为5mg/ml溶液；培养液应用灭菌蒸馏水、新生牛血清配制成含10%血清的细胞培养液,分别用0. 22μm的微孔滤器除菌, 4℃保存。 1.2 方法 1.2.1 消化　用0.25%的胰蛋白酶消化经传代稳定生长并且生长状态良好的贴壁Hela细胞,并用含10%新生牛血清的培养液吹打、配成均匀的近似单个细胞的悬液。 1.2.2 计数　细胞计数板计数后,用含10%新生牛血清的培养液调整细胞悬液的细胞浓度约为5×104个/ ml×104个/ ml×104个/ ml×104个/ ml2~3×104个/ ml，用于接种于药物处理。 96 孔板，每孔加入细胞悬液200 uL，使每孔内的细胞数约为5000个。 200μL接种于96孔培养板中,每一浓度4个平行孔。共设置1个空白对照组(1行,无细胞的含10%新生牛血清的培养液)，在2到6行中分别添加200μL 5×104个/ ml×104个/ ml×104个/ ml×104个/ ml2~3×104个/ ml96孔细胞培养板移入CO2培养箱中,在37℃、5% CO2 及饱和湿度条件下进行培养。 1.2.5 药物处理 在培养液内加入5-8组不同的5-实验药物浓度梯度： A组为1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml、1000ug/mlB组为20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml； C组为40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml、320ug/ml； D组为50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml； E、F组均为75ug/ml、150ug/ml、300ug/ml、600ug/ml, G组为200ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1600ug/ml； H组为300ug/ml、600ug/ml、900ug/ml、1500ug/ml； Hela细胞在培养箱内培养24h，吸出原培养液，加入以上不同浓度的5-药物培养液，每空添加200uL，每个浓度接种4孔作重复实验。换液后继续放回CO21.2.6 对照设置：本实验设置调零组（只加培养液、MTT、二甲基亚砜），1组对照组（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜）。 1.2.7 呈色：培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ ml的MTT溶液20 uL，CO24 h，终止培养：快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150 uL，振荡30min，使结晶物充分溶解。1.2.8 比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔的光吸收值，记录结果。2. 结果 全部利用Microsoft Excel进行分组处理 (表中每一数值=每浓度4孔的测定平均值-空白组测定平均值)。 细胞存活率=（实验组OD 值）/（对照组OD 值）×100%; 细胞增殖抑制率=[（对照组OD 值-实验组OD 值）/对照组OD 值] ×100%。若该值为正说明药物对细胞增殖具有抑制作用，若值为零表明对细胞增殖无影响；若值为负说明药物对细胞增殖具有促进作用。测量结果如表格1所示，B组、C组因为被细菌感染，故舍弃。1 不同浓度梯度的5-氟尿嘧啶对Hela细胞的影响 组别 浓度（ug/ml） 光密度（OD）值 存活率（%） 抑制率（%） A组 对照1101001000 0.5550.4070.2220.1460.130 73.3340.0026.3123.42 26.6760.0073.6976.58 D组 对照50100200400 0.7450.2750.2180.190.173 36.9129.2625.5023.22 63.0970.7474.5