探讨小麦硫转运蛋白基因RT-PCR半定量检测体系的建立.docVIP

科技大学 200 届毕业论文（设计） 题目：探讨小麦硫转运蛋白基因RT-PCR半定量检测体系的建立 姓 名: 专 业： 生物技术 学 院： 生命科学学院 指导教师： 完成日期： 2004年6月 小麦硫转运蛋白基因RT-PCR 半定量检测体系的建立 [摘要] 应用RT-PCR技术， 以Tubulin为内参基因，小麦硫转运蛋白基因(Sul)为检测基因，优化Mg2+浓度、退火温度、循环次数、引物浓度和Taq酶浓度，获得适宜的PCR反应参数，建立一个相对稳定、准确、特异的检测Sul表达量的半定量体系，为进一步研究小麦硫转运蛋白表达调节机制奠定技术基础。 [关键词] 小麦；Tubulin；硫转运蛋白基因；RT-PCR；半定量PCR To Establish a Method of Semiquantitative Polymerase Chain Reaction for Detecting Sul Gene Expression Abstract To establish a method of semiquantitative polymerase chain reaction for detecting Sulphate transporter gene expression in wheat roots，we established a semiquantitative PCR by putting primer of Tubulin served as internal reference gene and primer of target gene in the same conditions and optimizing experiment parameters for PCR such as the concentration of Mg2+ and cycle times etc. This method is usable to test the expressive level of Sul gene in the wheat roots. Key words：wheat；Sulphate transporter；RT-PCR；semiquantitative PCR 前 言 硫转运蛋白即硫酸盐转运蛋白，是一类主动运输硫酸根时所需的载体蛋白，也是植物体吸收、运输硫元素时的必需蛋白。硫元素是植物生长发育所必需的基本元素之一，它主要以SO42-形式被植物吸收，通过硫转运蛋白进入植物体后，大部分同化为含硫氨基酸（如胱氨酸，半胱氨酸和蛋氨酸）和辅酶A﹑硫胺素、生物素等维生素。因此硫转运蛋白植物原生质构成、能量固定、光合作用、固氮作用提高植物抗逆性等方面起到非常重要的作用。 近年来，由于农业生产的提高增加了单位面积上养分的输出，不含硫或含硫少的肥料的使用量增加，作物秸秆还田少或作其他用途，导致土壤缺硫现象越来越严重。硫缺乏已成为很多地区限制农业生产的重要因素之一，因而研究硫转运蛋白对提高小麦吸硫效率﹑提高小麦品质与产量有着非常重要的意义。 为了进一步探讨硫转运蛋白基因调控机制，有必要建立一种灵敏，简便，特异的半定量检测Sul mRNA表达的方法。逆转录多聚合酶链式反应(RT－RCR)技术法是近年来发展出来的探讨基因转录水平的有效手段。 因此本实验采用小麦为供试材料，以Tubulin为内参基因，Sul为检测基因，应用RT-PCR技术对小麦根部硫转运蛋白基因的表达进行半定量，建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系，为进一步研究其表达调节机制奠定基础。 一、材料与方法 （一）实验材料 采用郑引1号小麦。 （二）主要试剂 1、主要试剂 Hogland营养液，Trizol， M-MLV反转录酶，Taq酶和PCR其他相关试剂，DNA回收纯化试剂盒，0.5×TBE，琼脂糖。 2．引物 （1）Tubulin引物：根据Nemoto等设计的扩增小麦Tubulin基因片段的引物合成了上游引物Ⅰ和下游引物Ⅱ。 （2）Sul引物：根据小麦硫转运蛋白基因序列TAE分别自行设计和合成上游引物Ⅰ和下游引物Ⅱ。 （3）反转录引物：Oligo-d（T）。 （三）主要仪器 Eppendorf 5415D型离心机，RT-200型 PCR扩增仪，DYYⅢ型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），UVI凝胶成像系统。 （四）实验方法 1．材料准备 小麦种子用5% NaClO消毒10min，吸胀24h，萌发48h后，在完全Hogland营养液中光照培养至3叶期。 2．总RNA提取 取小麦根0.1g，置液氮迅速研磨，加Trizol 1000?l，室温静置5min