辣椒种子内辣椒轻斑驳病毒加热灭活研究.docVIP

精品论文 参考文献 辣椒种子内辣椒轻斑驳病毒加热灭活研究 东北林业大学生命科学学院 孙晶 付耕云 杨洪一 摘要：设置不同的处理温度和干热处理时间，利用干热空气热处理方法，筛选出对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒灭活效果好且具有较高的发芽率的灭菌条件。结果表明，75 ℃处理48 h 对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒具有较好的灭活效果，同时辣椒种子仍具有较高的发芽率，发芽率为95.6%。 　　关键词：辣椒轻斑驳病毒；加热灭菌；检测辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）是一种严重危害辣椒生产的种传病毒[1-3]。辣椒轻斑驳病毒侵染辣椒后，使辣椒呈现叶片皱缩、生长抑制、落花、果实变小等症状，对辣椒生产危害极大[4]。辣椒轻斑驳病毒能够通过种子进行传毒，种子内病毒可长时间存活并能随种子远距离传播。 　　人们通过对种子进行处理来控制一些病原体的措施已应用了很多年，黄瓜种子处理方式主要包括温汤浸种、干热空气处理和化学药剂处理（不同浓度盐酸、磷酸钠、病毒唑、高锰酸钾等）[5]。在各处理方式中，干热空气处理、磷酸钠处理是最常用的处理方式，国内外研究显示其可对病毒起到一定的灭活作用，但不同病毒处理效果不同，且较多处理措施影响种子发芽率。Rast 和Stijger 利用热空气处理、10%磷酸钠处理带有辣椒花叶病毒（Capsicum mosaic virs）的胡椒种子[6]，结果显示76 ℃处理3 d 并储存3 个月后，可有效灭活种子中的病毒，但严重影响种子萌发；而磷酸钠（100 g/L）处理2 h 可基本灭活种子中的病毒且不影响种子萌发。与此类似，在灭活番茄中的凤果花叶病毒（Pepino mosaic virus）研究中，磷酸钠起到了基本脱除病毒的作用，而干热空气处理（74℃处理48 h 或80℃处理24 h）在控制病毒的同时，也影响到了种子萌发[7]。本研究以干热空气处理方法为基础，对辣椒种子设置不同的处理温度和干热处理时间，筛选出对辣椒种子内的辣椒轻斑驳病毒具有较好的灭活效果，同时辣椒种子仍具有较高的发芽率的灭菌条件，为进一步控制种子内辣椒轻斑驳病毒的危害体提供重要参考。 　　1 材料和方法1.1 辣椒种子的干热处理将辣椒种子称量适量放于铝盒中，打开盖子放在烘箱中40℃温度下处理24 h，达到规定时间后取出，分别在70 ℃、75 ℃、80 ℃条件下做三组处理，每组处理种子100 粒。处理1：24 h干热处理；处理2：48 h 干热处理；处理3：72 h 干热处理。以不处理的种子为对照组CK。 　　1.2 病毒检测采用RT-PCR 技术，将处理后的每种种子各取出10 粒，对每粒种子进行研磨提取RNA、再用特异性引物进行RT-PCR 反应检测特异性条带，分析不同温度下，不同处理时间后种子的病毒率。根据文献[8-9] ， 合成引物Wup-F ：5-ATGGCGGAATTTGACCTATG-3 ； Wdow-R ：5-TTAGTTCCATCTGCCCATCC-3，PCR 扩增证实是否为辣椒轻斑驳病毒，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反应总体积25 mu;L，包括ddH2O 10 mu;L，Premix PrimeSTAR Hs 12.5mu;L（TaKaRa 公司），引物各0.5 mu;L（10 mu;mol/L），反转录产物30 ng。PCR 反应程序：94 deg;C 预变性5 min；98 deg;C，15 s；55deg;C，15 s；72deg;C，1 min，40循环；最后72 ℃ 延伸10 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，紫外灯下观察。 　　1.3 种子催芽萌发先将种子用纱布包好并做好标记，浸泡在常温水中2 h 后取出用棉布包好，保持湿润，使之处于常温催芽状态，每天洗种1 次，4 d 后开始每天记载发芽粒数，第7 d 计算发芽总数，统计各处理发芽率。整个试验期间的室温为25～34 ℃。 　　2 研究和分析2.1 种子带毒率分析将带病毒种子经40℃度下处理24 h，取出后再分别在70℃、75℃、80℃条件下做三组处理（每组种子100 粒）。处理1 为24 h 干热处理；处理2 为48 h 干热处理；处理3 为72 h干热处理。以不处理的种子为对照组（CK）。经上述处理后，采用改进的CTAB 方法提取单种子总RNA，并利用特异引物进行RT-PCR 反应检测病毒。检测结果见图1，从该图中可以看出，RT-PCR 检测扩增出一条大小为576 bp 的单一条带，表明辣椒种子内带有辣椒轻斑驳病毒。同时，70 ℃处理对种子内辣椒轻斑驳病毒影响很小，75 ℃和80 ℃处理对种子内辣椒轻斑驳病毒影响较大，可将多数种子内病毒灭活。 　　 图1 辣椒种子内辣椒轻斑驳