RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应 生命科学前沿 教学课件.ppt

* Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应 RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶 链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA 为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是 总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。 RT-PCR简介 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用OligodT或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。 再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR原理： 1，RNA提取； 2，RT；RNA-DNA 3，PCR RT-PCR实验步骤 RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。 1．RNA的提取 细胞1×107 or 组织100mg ↓ 加1mlTRIzol 细胞用1ml加样器吹至液体澄清 ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓ 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟, 离心12000g，15分钟 ↓ 转上层水相（约400μl）↓ 加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟, 离心 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml, 离心↓ 弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥） ↓ 溶于DEPC水中至20μl TRIzol法抽提总RNA 在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。 RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活， 如煮沸、高压灭菌等，RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子。 只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解。 RNA提取的最大影响因素-RNA酶 一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。 各种组织和细胞中则含有大量内 源性的RNA酶。 另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染； 操作人员的手汗、唾液等; 使用的RNA酶; 器械、玻璃制品、塑料制品。 RNA的纯度和完整性分析 实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）  先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中， 其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用， 实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡） （洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC） 试剂配制： 1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在 1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖  RNA 引物 Oligo(dT)↓ 混匀，离心，70℃ 5min ↓ 立即冰水浴，稍离心 ↓ M-MLV Buffer dNTP RNasin M-MLV ↓ 混匀，离心，42℃ 60min ↓ 95℃ 10min（破坏MLV） ↓ 4℃保存 2，逆转录反应 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 基因特异性引物 适用于具有PolyA尾巴的mRNA。（原核生物的RNA、真核生物的 rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高。 Oligo dT 适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 随机引物 RT-PCR引物的选择 3，PCR反应 95℃ 5分 预变性 94℃ 30秒 变性 X℃ 40秒 退火 72℃ 30秒 延伸 72℃ 7分 终末延伸 4℃保温 30循环 RT-PCR反应受多个因素影响， 引物退火的温度，对于具有较高Tm的引物， 增加退火和延伸时的温度 对反应有利； 扩增的循环数，大多数目标RNA经40轮PCR