巴西果仁致敏原的实时荧光PCR检测.pdfVIP

第25卷第4期 分 子 科 学 学 报 V01．25No．4 2009年 8月 J0URNAL OF MOLECULAR SCIENCE August2OO9 [文章编号]1000-9035(2009}04-0294-03 巴西果仁致敏原的实时荧光 PCR检测 蒋 丹，刘淑燕，徐君怡，齐震玉，王秋艳，曹际娟 (辽宁省 出入境检验检疫局 ，辽宁 大连 116015) [摘 要] 针对巴西果仁2SalbuminmRNA基因设计引物、探针，在实时荧光PCR仪上进行扩 增、检测和结果分析．结果显示：该组探针和引物对巴西果仁有很强的特异性，除巴西果仁外， 其余8种对照树果材料均未检测到荧光信号，巴西果仁成分检测灵敏度达到0．1％．该方法具 有灵敏度高、快速、简便的特点，可用于巴西果仁致敏原成分的定量检测． [关键词] 巴西果仁；致敏原；实时荧光聚合酶链式反应 [中图分类号] Q789 [学科代码] 180·71 [文献标识码] A 食物过敏医学上也称变态反应，是指机体受抗原(包括半抗原)刺激后，产生相应的抗体或致敏淋巴 细胞，当再次接触同一种抗原后在体内引起体液或细胞免疫反应，由此导致组织损伤或机体生理机能障 碍．它是一种复发率很高的疾病．引起变态反应的抗原被称为变应原，又名致敏原…1．根据流行病学调 查，近年来过敏症发病率呈逐年上升的趋势l2-3j．发达国家每年有超过20％的人受过敏性疾病的困扰， 我国的发病率高于发达国家 ．目前食物过敏尚属不治之症，患食物过敏症的消费者必须避免食用含 致敏原成分的食品．目前大约有 160多种食品致敏原，巴西果仁为常见的树果类致敏原之一，因此对巴 西果仁成分的检测尤为重要 ． 巴西果仁又名巴西坚果，是玉蕊科(Lecythidaceae)巴西栗属 (Bertholletia)植物巴西栗的果实，巴西栗 属只有巴西栗一个种_6J．原产于南美洲的圭亚那、委内瑞拉、巴西、哥伦比亚东部、秘鲁东部、玻利维亚东 部．零星的分布在亚马逊河、内格罗河、奥利诺科河沿岸的森林里． 本文采用实时荧光PCR技术检测巴西果仁成分．实时荧光PCR技术是近几年发展起来的新的检测 方法，该技术是在常规的反应体系中加入一条荧光标记探针，通过荧光信号的累积实现反应的实时监 控，目前已广泛应用于临床病原体、遗传病的诊断及转基因产品的检测等领域．TaqMan探针实时荧光 PCR是在常规PCR反应体系中添加了一条标记了2个荧光基团的探针．在探针的5端标记荧光报告基 团，在探针的3端标记荧光淬灭基团，两者可构成能量传递结构．在通常情况下荧光报告基团所发出的 荧光可被荧光淬灭基团吸收．当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告基团荧光信号增强．当在 PCR扩 增过程中，TaqMan探针同PCR产物杂交，由于TaqDNA聚合酶具有5端外切酶活性，在引物延伸阶段将 杂交在模板上的荧光探针 5端荧光报告基团切下，而脱落在溶液中，加大了与淬灭基团的距离，从而引 起报道基团发出荧光信号．随着PCR的进行，愈来愈多报道基团被切下，荧光信号也随着增强，它是模 板被PCR扩增，TaqMan探针与PCR产物杂交的直接标志．即只有在引物和探针都与模板杂交，才能检 测到荧光信号．如果探针不能与模板特异性的结合，即使在引物的作用下模板在PCR过程中得以扩增， 但检测不到荧光信号．实时荧光PCR仪就是根据上述原理，在 PCR过程中连续地检测反应体系中荧光 信号的变化．当信号增强到某一阈值时，此时的循环次数(CT)就被记录下来．该 CT值与PCR体系中起 收稿 日期：2OO8—12—20 基金项目：国家质量监督检验检疫总局公益性行业计划项 目(2007GYJ036) 联系人简介：曹际娟(1968．)，女，研究员，主要从事分子生物学研究． E-nlail：jiangdan66@hotmail．coin 第 4期 蒋 丹，等：巴西果仁致敏原的实时荧光PCR检测 295 始模板量的对数值有严格的线性关系．因此可定性确定反应体系中是否有模板 DNA，而且可相对确定 反应体系中DNA的量[71． 通过文献查阅及 BLAST比对，本文拟利