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Section 4 活力与比活力测定 ——纯化方案的评价 一 蛋白质含量测定 （一）概 论 自然界中蛋白质的种类多达1012- 14 ，其组成、结构、大小、特征与 性质相差巨大，加之在测定其含量时存在许多干扰因素，使得给出一个 十分理想又通用的蛋白质定量分析的方法是一个巨大的问题；这样就形 成了很多不同的蛋白质含量测定方法，它们各有千秋，独领风骚。 蛋白质浓度测定方法 直接测定 物理特性 紫外吸收法 吸附性 氨基黑法 考马斯亮蓝法 银染法 间接测定 螯合性 荧光法 western blot 化学性质 凯氏定氮法 双缩脲法 Folin-酚法 BCA法 为具体实验样本选择一个合适的蛋白质含量测定方法，这是个question ，但是很重要 （二）Folin-酚法 Folin-酚法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙 两种试剂组成的。 甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成； 在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色二价 铜—蛋白质络合物，使得肽键伸展，酪氨酸和色氨酸残基因此完全暴露； 乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成； 在酸性条件下，二价铜—蛋白质络合物上完全暴露在外的酪氨酸和色氨酸 残基还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）， 可用500nm波长比色测定，在一定范围内，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。 该法适合测定的蛋白质含量范围是 0.05～0.5g/L 优点： 简单、迅速、灵敏度高，反应较稳定 缺点： 受多种因素的干扰 蛋白质 甲试剂 (酒石酸钾钠铜盐) OH〄碱性条件 混匀 紫红色二价铜—蛋白质络合物 舒展而暴露 酪氨酸和色氨酸残基 乙试剂 (磷钼酸和磷钨酸 ) OH〄碱性条件 即刻混匀！！！ 酚类、柠檬酸、硫酸铵、 深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物 Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、 甘油等均有干扰作用。浓 乙试剂仅在酸性条件下 度较低的尿素（0.5%）， 稳定，但该还原反应只 500nm波长比色测定 硫酸纳（ 1%），硝酸纳 在pH=10的情况下发生， （1%），三氯乙酸 故滴加后必须立即混匀， （0.5% ），乙醇（5%）， 标曲比对 以便