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* 衰退与复壮的概念 衰退（degeneration）：在微生物的生长过程中，由于变异的存在，使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退。 衰退的原因： 有关基因负突变 1）多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏： 细菌：1个月 酵母菌：3个月 放线菌、霉菌、芽孢：半年 2）培养条件； 3）诱变时出现不纯菌落。 * * 芩沛森177 2.2 冻干保藏 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。 培养物的冻干过程 冻干菌种的保藏与再生 1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。 2．复苏： (1)在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。 (2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿． (3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。 (4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。 矿物油中浸没保藏 将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。 可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。 浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。 以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。 干燥保藏 微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌芽孢或产分生孢子的菌种，是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护作用，通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大(小)米等。 沙土管法 取河(海)沙，过0.78mm(24目)筛，用10％盐酸浸泡24h，倒去盐酸用清水冲洗至pH呈中性，去水烘干或晒干。取菜园或果园土粉碎过筛，把烘干的沙土按3：2或1：1混合装入指形管或高100mm，直径为10mm的小试管中，高约1cm(约2g)，塞棉塞121℃灭菌1h，也可用170℃2h干热灭菌(或蒸汽三次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液(≥106/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约0.3～0.5ml，用接种环将其混合均匀。 沙土管法 也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入沙土中。然后将沙土管抽真空干燥。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等干燥剂，于4℃下保存。从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后，可以不抽真空直接放干燥器内保存。 沙土管法 在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好，保藏的有效时间与菌种存活率的关系见图2-10。 用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年(新霉素产生菌)，但对利福霉素、卡那霉素、四环素等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。 沙土管法 滤纸保藏法 本法是将要要保藏的微生物细胞或孢子吸附在灭菌滤纸上，干燥后冷藏。其方法是3#滤纸剪成5mm×50mm的小条，放入干燥的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中，充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，真空条件下火焰熔封，冷藏。 大(小)米保藏法 是根据我国制曲原理加以改进的一种方法。此法是将曲霉等大量产