实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定.docVIP

实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 实验方案： （一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液 一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用 二、实验原理： 1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞 匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CAT由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机 离心力 分离固液 三、实验步骤： 1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g 2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,组织捣碎机匀浆3-5min 3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5、【留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS检测，-20℃冰箱保存。另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。 （二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶 一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理 二、实验原理： 1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程 2、盐酸沉淀原理 ： 中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出 3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子的一种分离纯化技术 三、实验步骤： 向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态下浴搅拌1h； 将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀； 用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀； 留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测，-20℃冰箱保存。 将透析袋（截流量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用。 将上清液放入透析袋，（截流量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L，pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液）中透析一周，中途更换一次透析液； 一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃6000rpm，10min）后，弃上清，收集沉淀； 用2ml~3ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH4.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶），离心（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。（测OD280，若蛋白浓度小于1mg/ml） 留样：取透析后上清样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测，-20℃冰箱保存。 10. 将透析袋置于沸水中煮沸15min，清洗晾凉后备用 11 .将收获的样品液放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩两个小时将样品浓缩至400-500ul收样，放置4℃ （三）凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶 一、实验目的： 二、实验原理： 三、实验步骤： 1、凝胶的处理：每组取2.5g sepadexG-200葡聚糖凝胶干粉，浸泡与蒸馏水充分膨胀倾斜法除去表面的悬浮小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），继续浸泡一天 2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填上一层海绵垫。将层 析柱将垂直夹与铁架上，将层析柱下端额止水架夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱。当凝集颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高达35cm时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡，表面要平整。 3、平衡：打开层析柱口，控制流速为0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min），用磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8）流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm 的高度不得出现干胶和断层，应保持凝胶面平衡 4、浓缩样品（前次实验已经操作） 5、加样：打开层析柱口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面齐平时，关上出口。用吸管吸取待分离的浓缩后的样品溶液400-500ul，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。待样品液恰好完全进入