液相基本原理与应用.pptxVIP

高效液相色谱法（ High performance liquid chromatography ）原理及其应用2018.01.09一、引言：食品检测常用分析仪器的简单分类及用途1、主要分类：1、紫外分光光度计：亚硝酸盐，游离氯，二氧化硫等；2、原子荧光光谱仪：汞、硒、砷等元素；光谱类3、原子吸收光谱仪：Fe、Zn、Al、Cu等常规元素；4、电感耦合等离子体质谱仪：大多数元素。1、离子色谱：氯离子、硫酸根、Na+等离子；色谱类2、气相色谱：农残、挥发性有机化合物等；3、液相色谱：添加剂、毒素、农残、兽残。1、液质联用：添加剂、毒素、农残、兽残；质谱类2、气质联用：农残、挥发性有机化合物；3、ICP-MS：大多数元素。2.其他仪器：A：分子荧光光谱。B：红外光谱、质谱（碳谱、氢谱）、核磁共振：主要用于结构解析。二、液相色谱法的一些基本概念1．“色谱法”：起源于1906年由俄国植物学家Tsweet创立的植物色素分离。 定义：利用各组分物理化学性质的不同，在流动相流经固定相时，由于各组分在两相间的吸附、分配或其它亲和力的差异而产生不同速度的移动，最终达到分离的目的。 形象的描述为色谱法，但是现在已经超越了最初的范畴。 分离的基础：差速迁移。 分离的机制：各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。 吸附→解吸→再吸附→再解吸→无数次洗脱→分开图示：植物色素混合物固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚 返回2.反相色谱法定义–固定相(Stationary Phase)（固定的）。是色谱的一个基质，它能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解和交换等作用。–流动相(Mobile Phase)（流动的）。是在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体或气体。反相分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性正相分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性3.色谱基本概念塔板3.色谱基本概念3.色谱基本概念3.色谱基本概念 分辨两个等高峰的峰谷R0.6；能定量R1;基线分离并能准确定量R1.6；耐用方法R1.73.色谱基本概念流出曲线和色谱峰基线、噪音和漂移峰宽—柱效参数保留值—定性参数理论塔板数—衡量柱效的参数二、HPLC仪器构造五大模块高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置进样系统：进样器，进样阀分离系统：色谱柱，恒温箱检测系统：检测器数据处理和计算机控制系统：记录装置、色谱工作站1、泵（输液系统）低压泵前混合：溶剂在常压下混合，然后用一个高压输液泵把混合液输送至系统中。方法简单、经济，而且只需一个泵，所用溶剂元数没有限制（一般最多为四元） 高压泵后混合：溶剂首先经过高压泵加压，然后在混合室内混合。高压梯度一般使用两台高压输液泵，每台输送一种溶剂（一般最多为二元），梯度准确性好 注意：低压混合一般需在线脱气，否则极易出气泡。高压混合不易出气泡。2、六通阀（进样系统）InjectLoad3.色谱柱（分离系统）柱管：玻璃、PEEK、不锈钢（耐压，不宜变形）填料：金属氧化物(Al2O3等)、硅胶（SiO2）、聚合物（聚合的苯乙烯二乙烯苯等）等等。类型：C18—又称ODS柱； C8—类同于C18柱；NH2—常用于大分子的糖分析；C6H5—苯基柱，适合芳香族化合物的分离；CN—用于某些杂环化合物的分离；OH—二醇基柱；Si—硅胶柱，典型的正相柱，适合极性化合物的分离，流动相多为非极性的溶剂；Hilic柱—反反相色谱柱4.检测器（检测系统）紫外可变波长检测器（VWD）：原理：朗伯比尔定律，光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目。二极管阵列检测器（PDA、DAD）：原理与VWD一致。而且可同时得到多个波长的色谱图，可以对峰进行纯度检验和紫外定性；可以得到时间-波长-吸收值为坐标的三维图形。荧光检测器（FLD）：原理：电子跃迁，基态-激发态-基态，释放光量子。要注意荧光淬灭。4.检测器（检测系统）示差折光检测器（RID）：原理：化合物的折光率不同，光会偏转，折光的程度与样品的浓度成正比。注意：不能使用梯度洗脱，检测器耐压低，流速要恒定，温度要恒定，不能有震动。蒸发光散射检测器（ELSD）：原理：色谱柱流出液进入雾化器形成微小液滴，与通入的气体 (通常是氮气)混合均匀，经过加热的漂移管，蒸发除去流动相，样品组分形成气溶胶，气流将这些溶质颗粒带入到检测区，用强光或激光照射气溶胶，产生光散射，用光电二极管检测散射光。散射光的强度(I)与组分的质量(m)有下述关系： I=km 或lgI=b lgm+lgk 其中k和b为与蒸发室(漂移管)温度、雾化气体压力及流动相性质等 实验条件有关的常数。 接色谱柱石英窗UV光电倍增管废液图例1、VWD，最常用的通用型检测器图例2、PDA时间、光