卫生化学精品教学（中山大学）分子荧光分析法.pptVIP

分子荧光分析法 根据保利(Pauli)不相容原理，一个给定轨道中的两个电子必定具有相反的自旋（方向），这种分子在磁场作用下，不会发生能级分裂，称为单重态 如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子具有两个自旋方向平行的电子，这种分子在磁场作用下，会发生能级分裂*，称为激发三重态 *：以一个能级状态分裂成三个能级状态 一、分子的电子能级与激发过程 大多数分子电子配对，自旋方向相反----基态单重态 吸收辐射，电子被激发到较高能级，自旋方向不变 -----激发单重态 如两个电子自旋不再配对，而是相互平行-----激发三重态(能级稍低于激发单重态) 这一过程只能发生在同一级电子能级内，即分子通过碰撞以热的形式损失部分能量，从较高振动能级降低到该电子能级的最低振动能级上 由于这一部分能量以热的形式释放，而不是以光辐射形式发出，故振动弛豫属于无辐射跃迁 振动弛豫---处于高振动能级的电子，以热能形式将能量传递给溶剂分子，转移到低的振动能级(见右图) 无辐射跃迁,只在同一电子能级内进行 (2) 内部能量转换(内转换)  即激发态分子将多余的能量转变为热能而降至较低的电子能级 内转换也属于无辐射跃迁 内部能量转换----当两个电子能级非常接近,以至于振动能量重叠时,电子以无辐射跃迁而转移到较低能级(见右图) 对于一个较高受激态，通过振动能级重叠，而发生的内转换往往比通过荧光失去能量的几率更大 (3) 荧光发射 较高激发态分子经无辐射跃迁降至第一激发单重态的最低振动能级后，仍不稳定，停留较短时间后（约10-8秒，称做荧光寿命），可继续以无辐射跃迁形式返回基态，也可以光辐射形式放出能量回到基态各振动能级，这时分子所发射的光称为荧光(fluorescence) 共振荧光 (λex=λem) 非共振荧光(λexλem) 激发态分子经过振动弛豫、内转换回到第一电子激发态的最低振动能级,发出光量子,分子跃迁到基态的各个不同振动能级,这时分子发射的光称为荧光(见右图) 由于振动弛豫损失了部分所能量,荧光的能量小于原来吸收的紫外光能量。所以λem λex (λ =hc/ΔE) (4) 系间跨越 有些物质的激发分子通过振动弛豫和内转换下降到第一电子激发态最低振动能级后，有可能经过另一个无辐射跃迁转移至激发三重态，这一过程伴随着自旋方向的改变，称为系间跨越 系间跨越----是指一个受激分子的电子在激发态发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程 即激发分子通过无辐射跃迁至激发三重态的高振动能级上(见右图) 荧光强度减弱甚至熄灭 (5) 外部能量转换(外转换) 外部能量转换----受激分子与溶剂或其它溶质的相互碰撞而失去能量,并以热能释放能量 外转换会降低荧光强度 (低温、高粘度→碰撞减少，外转换↘荧光F↗) (6) 磷光发射  经系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，停留一段时间（10-4～10秒，称做磷光寿命），然后以光辐射形式放出能量返回到基态各振动能级，这时发出的光称为磷光 磷光发射----经过系间跨越的分子通过振动弛豫降至三重态的振动基态，分子在三重态的振动基态可以存活一段时间(故磷光要延迟发生),然后发出光辐射跃迁至基态的各个振动能级 在室温下溶液很少呈现磷光 通过冷冻或固化减少外转换才能检测磷光 由于激发三重态能量比激发单重态最低振动能级能量低，故磷光辐射的能量比荧光更小，即磷光的波长比荧光更长 M + hv → M* (激发态的粒子)寿命10-8—10-9s 物质 光子 去激发过程 M + hv 荧光或磷光(光致发光) 荧光分析法是利用荧光特性和强度，对物质进行定性和定量分析的方法 （一）荧光的检测激发光（λex），照射到样品溶液上，激发样品产生荧光。溶液的荧光在各个方向上都有发射，但由于一部分激发光可透过溶液，为了防止透射光的干扰，应在与激发光垂直的位置上检测不同发射波长（λem）下的荧光强度。 （二）激发光谱与荧光光谱的形成 荧光属于分子的受激发射光谱。因此任何荧光化合物，都具有两种特征光谱，即激发光谱与荧光（发射）光谱。 1. 荧光光谱形状与激发光波长无关  这是由于荧光是分子从第一电子激发态的最低振动能级返回基态的各振动能级时释放的光辐射，与分子被激发至哪个电子激发态无关。所以荧光光谱的形状与激发光波长无关。 2. 荧光光谱比激发光谱波长较长 荧光物质分子被激发至较高激发态后，先经无辐射跃迁损失掉一部分能量到达第一电子激发态最低振动能级，再由此发出荧光。因此荧光发射能量比激发能量低，故荧光光谱比激发光谱波长较长。