第三章基因工程制药第9、10节.ppt

第九节 基因工程药物的质量控制 是利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构，还参与生理功能的调节，用量极微，任何质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。 宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。 一、 原材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。 根据质量控制要求应了解以下 特性： ⒈明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证； ⒉应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物； ⒊ 应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特性； ⒋须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性； ⒌提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。 原始种子批须确证克隆基因DNA序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳定性。 对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高允许传种代数； 在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞-载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。 培养周期结束时，应监测宿主细胞-载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。 三、纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白质、DNA与热源质控制在规定限度以下。 在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测方法。 四、目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求:产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的鉴定方法。 ⒈产品的鉴别 常用的鉴定方法: 电泳方法: SDS、等电聚焦、免疫电泳 免疫学方法: 放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA) 受体结合试验 高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列分 析、圆二色谱、核磁共振 ⑴ 肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用HPLC、毛细管电泳。 ⑵ 氨基酸成分分析 50个氨基酸较理想 ⑶ 部分氨基酸序列分析 N端15个氨基酸可作为重 组蛋白质和多肽的重要鉴 定指标。 ⑷ 重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定 蛋白质浓度测定方法有:福林-酚法、双缩脲法 蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤法、SD-SPAGE法 ⑸ 蛋白质二硫键分析 测定方法有: 对氯汞苯甲酸法等 5，5’-二硫基双-2-硝基苯甲酸法 ⒉ 纯度分析 ⑴蛋白质含量测定 SDS、等电聚焦、各种HPLC、 毛细管电泳 ⑵杂质 ①蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白 采用免疫分析的方法 ②非蛋白类杂质 ②非蛋白类杂质 非蛋白类杂质主要有: 病毒、细菌等微生物、热原、 内毒素、致敏源及DNA。 常用检测方法： 杂质和污染物 检 测 方 法 内毒素 鲎试剂、家兔热原法 宿主细胞蛋白 免疫分析、SDS、CE 其它蛋白杂质 免疫分析、SDS、 HPLC、CE 残余DNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合 蛋白变异 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 甲酰蛋氨酸 肽谱、HPLC、 IEF、 CE 蛋氨酸氧化 肽谱、HPLC、 质谱、氨基酸分析 产物