第九章 酶分子的定向进化.ppt

* * 第八章 酶分子的定向进化 广州大学生命科学学院 柯德森 第一节 酶分子定向进化简介 一.概念: 分子定向进化：在实验室试管中模拟达尔文的自然进化原理，对蛋白质(酶)的基因利用随机突变和随机杂交的方法加以改造，通过大规模筛选，从而得到性能上改良的优异变种。使蛋白质(酶)在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短至几个月，为蛋白质(酶)的工程应用提供了一个强有力的技术手段。 属于蛋白质的非合理设计,它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制,人为地创造特殊的进化条件,模拟自然进化机制(随机突变,基因重组和自然选择),在体外改造酶,并定向选择(筛选)出所需要性质的突变酶. 可以促使群体生物大分子向任意功能目标进化，从而获得或改良功能大分子。 可以在几星期或几个月增强基因或蛋白质的某种特性，将可用于制造副作用更小的新药物、营养价值高的作物品种，或更有益于环境的化学加工等等。 一.基本原理: 合理设计与非合理设计:在比较充分了解酶的结构和功能的基础上对酶分子进行改造,称为合理设计;不需要准确的酶分子结构信息,通过随机突变,基因重组,定向筛选等方法对其进行改造,称为酶分子的非合理设计. 非合理设计实用性较强,往往可以通过随机产生的突变改进酶的特性. 其基本技术手段:易错PCR,DNA重组,高突变菌株等技术. 达尔文进化 所有自然界存在的酶均是基于自然选择的达尔文进化的产物。受自然界中成就的启发，科学家们开始掌握和应用这一进化理论，在实验室中完成达尔文进化，这不仅包括生物机体与细胞水平，还包括在单个的生物大分子水平上。 达尔文进化主要包括重复进行的三个过程：选择、扩增和变异 第二节 定向进化的策略 易错PCR: 使用Taq酶进行PCR扩增目的基因时,通过调整反应条件,例如提高Mg2+浓度,加入Mn2+,改变体系中四种dNTP的浓度等,改变Taq酶的突变频率,从而向目的基因中,以一定的频率随机引入突变构建突变库然后选择或筛选需要的突变体. 连续易错PCR:即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变积累而产生重要的有益的突变. 第二节 定向进化的策略 DNA改组技术:是一种有性PCR,将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起组成新的突变基因库.其基本的操作过程是从正突变基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随机切割,得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环,随机引物片段之间互为模板和引物,直到获得全长的基因,这导致来自不同基因片段之间的重组.该策略将来自亲本基因中的优势突变尽可能地组合在一起,在理论上优于连续的易错PCR等无性进化的策略. 定向进化的选择策略: 筛选的方法必须灵敏,至少与目的性质相关; 筛选的方法必须有明显的可供测量的信号; 选择的标准必须是合乎研究目的的指标 突变体的构建及应用 (一)构建理想基因文库要考虑的因素: 1.基因文库的质量:文库的代表性和突变基因片段的完整性 文库的代表性:指文库包含的DNA分子是否能完整地反映出来源基因的全部可能的变化和改变,是体现文库质量的最重要指标; 突变基因的完整性:突变DNA片段应尽可能地完整反映出基因的结构. (二)构建突变文库的载体系统:优缺点 1.噬菌体载体系统:优点为可以装载容量大的,适合于大片段的克隆.较好的质量控制;缺点:可采用的文库筛选方法有限,常常在载体系统中无法表达. 2.质粒载体系统:操作方便,可塑性强,能够实现对基因文库的功能筛选. 缺点:插入片段的容量较小. (二)构建突变文库的载体系统:优缺点 3.哺乳动物细胞表达系统:是一个新动向,已显示了良好的前景. 文库的筛选策略: 两种基本策略: 根据已知基因编码产物的特定活性进行筛选.这种方法可以很直观快速地检出有效突变的基因.但需要有比较直观和明显的生物学检定形状的出现. 不需要附加任何条件,通过检测在特定条件下来源于两个文库的基因编码产物之间发生相互作用的情况,从而确定这两个文库中的所有可能在生理上发生相互作用的基因对,描绘出某一特定类型细胞内表达出基因之间发生的基因相互作用联络图. 2.筛选方法: 基于基因编码蛋白质的检测筛选表达文库:前提条件是文库中的基因必须在宿主细胞中获得功能性表达. 嗜菌体表面展示系统:是通过体外富集策略进行基因文库筛选的一种具体方法; 酵母双杂交系统 酵母单杂交系统: 酵母双杂交系统 双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。 80年代的工作表明, 转录激活因子在结构上是组件式的(modular), 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激